抗過敏藥物異丙嗪加重清開靈注射液致心律失常作用的研究.pdf

1、目的:
　　清開靈注射液發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)時(shí)，常用抗過敏藥物異丙嗪來進(jìn)行治療。已有臨床前及臨床數(shù)據(jù)研究證明，清開靈能導(dǎo)致潛在的心律失常，本研究對(duì)抗過敏藥物異丙嗪用于搶救清開靈注射液引起的嚴(yán)重不良反應(yīng)患者的方案提出了質(zhì)疑，通過臨床前的心臟安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，來驗(yàn)證異丙嗪可加重清開靈注射液所致的緩慢性心律失常作用。
　　藥品:
　　1.清開靈:清開靈注射液(QKL)，批號(hào):11040664，國(guó)藥準(zhǔn)字Z13020880，河北神威藥

2、業(yè)有限公司生產(chǎn)。
　　2.異丙嗪:異丙嗪鹽酸鹽(Promethazine，PMZ)，批號(hào):1001154582，是從Sigma-aldrich公司購(gòu)買。
　　方法:
　　1.豚鼠在體心電圖記錄:
　　20％烏拉坦(5mL/kg)對(duì)豚鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，以仰臥位進(jìn)行固定，分離出一側(cè)頸靜脈，進(jìn)行插管，再給藥。四肢皮下扎入針形電極引導(dǎo)記錄Ⅱ?qū)?lián)心電信號(hào)，經(jīng)四道生理記錄儀采樣并存入計(jì)算機(jī)。于靜脈推注藥物5 min后記錄心

3、電圖，分析心率、P-R間期、QRS間期和QTc間期。
　　按照清開靈注射液說明書所規(guī)定的:成人用量為每次40 ml，在體實(shí)驗(yàn)采用40ml為1倍臨床劑量。按國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)豚鼠用劑量為人用劑量的4.6倍，換算為豚鼠在體1倍劑量為3.1 ml/kg。按照注射用異丙嗪鹽酸鹽說明書所規(guī)定的:抗過敏用量每次25 mg，最高量不得超過每次100mg，在體實(shí)驗(yàn)中采用臨床最高用量100 mg/60 kg為1倍臨床劑量。同樣按國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)換算為豚鼠在體1/2倍

4、劑量為3.83 mg/kg，1倍劑量為7.67 mg/kg，2倍劑量為15.33 mg/kg，5倍劑量為38.35 mg/kg。
　　2.豚鼠離體心電圖記錄:
　　采用改進(jìn)的Langendoff灌流系統(tǒng)，經(jīng)主動(dòng)脈進(jìn)行離體心臟灌流，心臟復(fù)跳后在心外膜下置3根銀絲電極:正極置于心尖處，負(fù)極置于右心房，接地電極置于主動(dòng)脈根部，引導(dǎo)出離體心臟心電圖。待豚鼠心臟跳動(dòng)穩(wěn)定后，信號(hào)經(jīng)四道生理記錄儀輸入計(jì)算機(jī)記錄，分析心率、P-R間期、QR

5、S間期和QTc間期。
　　清開靈注射液的說明書規(guī)定成人用量為40 ml。按成人體重60 kg為例計(jì)算;成人細(xì)胞外液約為12000ml(按體重的20％算)，因此換算成臨床血藥濃度即為3.3 ml/L。據(jù)上述方法換算后，離體實(shí)驗(yàn)的組織和細(xì)胞灌流液1倍臨床濃度為3.3 ml/L，10倍臨床濃度為33 ml/L。根據(jù)之前的預(yù)實(shí)驗(yàn)可得知，單獨(dú)異丙嗪實(shí)驗(yàn)，采用的濃度為0.1、1、10和50μmol/L，與清開靈合用時(shí)采用1、10、30和50μ

6、mol/L。
　　3.豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位記錄:
　　用20％烏拉坦(5 mL/kg)對(duì)豚鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉后，快速開胸取出心臟，置于0～4℃無(wú)鈣灌流液中使之停搏，修剪，取出左心室乳頭肌1條，將其固定于恒溫浴槽底部。充以95％ O2+5％ CO2飽和的含鈣臺(tái)氏灌流液，在恒溫(36±0.5℃)下以5ml/min的速度恒速灌流，標(biāo)本在浴槽內(nèi)穩(wěn)定1小時(shí)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。給予強(qiáng)度為1.5倍閾值，波寬10 ms，刺激頻率1Hz的方波刺激。信號(hào)

7、經(jīng)四道生理記錄儀輸入計(jì)算機(jī)記錄。
　　4.大鼠左心室肌細(xì)胞L型鈣電流記錄:
　　采用改良的酶解法分離獲取大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞。采用膜片鉗全細(xì)胞記錄方法，在室溫(20-22℃)下進(jìn)行。將細(xì)胞懸液數(shù)滴加入倒置顯微鏡上的灌流槽中(RC-26，Recording Chamber150μL，USA)，細(xì)胞貼壁后，用電流記錄外液灌流。選取邊緣無(wú)卷曲，橫紋清晰，表面無(wú)顆粒，無(wú)收縮的細(xì)胞進(jìn)行封接實(shí)驗(yàn)。玻璃毛細(xì)管(Sutter instrume

8、ntO.D.1.5mm，I.D.1.1 mm with filament)經(jīng)微電極拉制儀制成尖端直徑約為1μm的電極，電極充灌電流記錄內(nèi)液后，入水阻抗約為5 MΩ。調(diào)節(jié)三維操縱器使電極尖端移向細(xì)胞表面進(jìn)行封接，阻抗達(dá)到1 GΩ以上后補(bǔ)償快電容，并給予負(fù)壓破膜形成全細(xì)胞記錄模式，調(diào)節(jié)慢電容補(bǔ)償和串聯(lián)電阻補(bǔ)償，以減少瞬時(shí)充放電電流和鉗制電位誤差。鉗制電壓為-80 mV，階躍到-40 mV并維持200 ms（使Na+電流失活），然后施加到0m

9、V、300 ms的試驗(yàn)電壓。在電壓鉗制模式下，記錄用藥前后L型鈣通道的變化。
　　無(wú)鈣灌流液(mmol/L):NaCl117，KCl5.7，NaHCO34.4，NaH2PO41.5，MgCl21.7,HEPES20, Glucose20,Taurine10, pH用NaOH調(diào)至7.4。
　　KB液組成為為(mmol/L): L-glutamic acid50，KCl40，KH2PO420, Taurine20,MgCl2·6

10、H2O3, KOH70, EGTA0.5, HEPES10, Glucose10.pH用NaOH調(diào)至7.4。
　　電極記錄外液組成為(mmol/L): NaCl132，CsCl5.4，CaCl21.8，MgCl2·6H2O1.8,NaH2PO4·2H2O0.6,4AP5,HEPES10, glucose·H2O10, Na-pyruvate5.pH用NaOH調(diào)至7.4。
　　電極記錄內(nèi)液組成為(mmol/L): CsCl13

11、0， MgCl2·6H2O2，EGTA11, HEPES20,glucose·H2O10, Na2ATP2,GTP0.1.pH用NaOH調(diào)至7.4。
　　5.全細(xì)胞電壓鉗記錄hNav1.5電流:
　　合成的hNav1.5 cDNA(NM_000335.4)被克隆到帶有G418耐藥性表達(dá)載體pcDNA3.1。構(gòu)成的質(zhì)粒在脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑作用下，轉(zhuǎn)染至HEK(human embryokidney)細(xì)胞系中。在Dulbecc

12、o's改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基上培養(yǎng)（10％小牛血清和250μg/ml G418) hNav1.5細(xì)胞株，通過規(guī)范的次代培養(yǎng)以維持最適宜的狀態(tài)用于hNav1.5電流記錄。
　　采用膜片鉗全細(xì)胞記錄方法，在室溫(20-22℃)下進(jìn)行。
　　鉗制電壓為-80 mV，階躍到-20 mV維持20 ms。電流信號(hào)經(jīng)膜片鉗放大器放大并經(jīng)數(shù)字-信號(hào)轉(zhuǎn)換器與計(jì)算機(jī)對(duì)話，信號(hào)的發(fā)放和采集均由pClamp10.0軟件完成。
　　記錄外部溶液

13、(mmol/L): NaCl25、TEACl122、MgCl21、Glucose10、HEPES10、CaCl21.8，pH用NaOH調(diào)至7.4，滲透壓值用sucrose調(diào)至290 mOsm。
　　記錄內(nèi)部溶液(mmol/L): CsF129、MgCl22、EGTA11、HEPES10、Na2ATP3、pH用CsOH調(diào)至7.2，滲透壓值用sucrose調(diào)至290 mOsm。
　　6.全細(xì)胞電壓鉗記錄hERG電流:
　　

14、合成的hERG cDNA(NM_000238.2)被克隆到帶有G418耐藥性表達(dá)載體pcDNA3.1。構(gòu)成的質(zhì)粒在脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑作用下，轉(zhuǎn)染HEK(human embryo kidney)細(xì)胞系中。在Dulbecco's改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基上培養(yǎng)（10％小牛血清和250μg/ml G418）hERG細(xì)胞株，通過規(guī)范的次代培養(yǎng)以維持最適宜的狀態(tài)用于hERG電流記錄。
　　采用膜片鉗全細(xì)胞記錄方法，在室溫(20-22℃)下進(jìn)

15、行。鉗制電壓為-80 mV，階躍到-50 mV維持50 ms，然后施加到50 mV4800 ms試驗(yàn)電壓，最后施加到-50 mV5000 ms試驗(yàn)電壓。電流信號(hào)經(jīng)膜片鉗放大器放大并經(jīng)數(shù)字-信號(hào)轉(zhuǎn)換器與計(jì)算機(jī)對(duì)話，信號(hào)輸入經(jīng)過1kHz的濾波，信號(hào)的發(fā)放和采集均由pClamp10.0軟件完成。
　　結(jié)果:
　　1.異丙嗪及合用清開靈注射液對(duì)豚鼠在體心電圖的影響:
　　清開靈注射液在3.1 ml/kg和15.5 ml/kg時(shí)

16、，對(duì)豚鼠在體心電圖的P-R、QRS、QTc間期及心率(P＞0.05)未能有顯著改變;在清開靈注射劑31 ml/kg和93 ml/kg時(shí)，呈劑量依賴性的延長(zhǎng)豚鼠的QRS間期及QTc間期，而且清開靈注射液93 ml/kg時(shí)還能顯著性地延長(zhǎng)P-R間期(P＜0.05)。對(duì)于異丙嗪而言，3.83 mg/kg（1/2臨床劑量）和7.67mg/kg（1倍臨床劑量）沒有明顯改變豚鼠在體心電圖的心率、P-R、QRS以及QTc間期(P＞0.05);異丙嗪1

17、5.33 mg/kg（2倍臨床劑量）顯著的延長(zhǎng)了QRS間期;異丙嗪38.35 mg/kg（5倍臨床劑量），顯著減慢心率以及延長(zhǎng)P-R、QRS以及QTc間期。清開靈注射劑31 ml/kg時(shí)能顯著延長(zhǎng)豚鼠心電圖的QRS間期以及QTc間期，當(dāng)清開靈注射劑31 ml/kg合用異丙嗪38.35 mg/kg劑量時(shí)，能進(jìn)一步延長(zhǎng)清開靈注射液以及清開靈注射液合用7.67 ml/kg作用下的P-R、QRS以及QTc間期，而且對(duì)豚鼠心率有顯著性減慢的作用(

18、P＜0.05)。
　　2.異丙嗪及合用清開靈注射液對(duì)豚鼠離體心電圖的影響:
　　33 ml/L的清開靈注射液顯著地延長(zhǎng)QRS間期(P＜0.05);清開靈注射劑在66和99 ml/L時(shí)顯著減慢心率并顯著延長(zhǎng)P-R，QRS間期(P＜0.05)，而且在99 ml/L時(shí)還能顯著延長(zhǎng)其QTc間期(P＜0.05)。對(duì)于異丙嗪而言，濃度為10μmol/L時(shí)明顯減慢離體豚鼠心臟心率(P＜0.05)及延長(zhǎng)QRS間期;50μmol/L的異丙嗪能

19、明顯減慢豚鼠心臟心率而且顯著延長(zhǎng)QRS間期和QTc間期(P＜0.05)。當(dāng)選用33 ml/L清開靈注射液作為基礎(chǔ)濃度，再合用1、10、30、50μmol/L的異丙嗪，心率出現(xiàn)不同程度濃度依賴性減慢，還進(jìn)一步延長(zhǎng)了清開靈作用下的P-R間期、QTc以及QRS間期(P＜0.05)。再用清開靈33 ml/L進(jìn)行洗脫后，各參數(shù)會(huì)出現(xiàn)部分恢復(fù)。
　　3.異丙嗪及合用清開靈注射液對(duì)豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位的影響:
　　單獨(dú)灌流99μl/ml的清

20、開靈注射液，豚鼠的左心室乳頭肌的動(dòng)作電位未見消失，而濃度達(dá)到165μl/ml時(shí)動(dòng)作電位部分消失。對(duì)于異丙嗪而言，濃度為26μmol/L時(shí)，未出現(xiàn)動(dòng)作電位消失。而當(dāng)清開靈注射液99μl/ml合并異丙嗪10μmol/L時(shí)，動(dòng)作電位就能出現(xiàn)部分的消失。同時(shí)再進(jìn)行灌流液洗脫后，發(fā)現(xiàn)動(dòng)作電位又可以恢復(fù)到正常。這就表明異丙嗪和清開靈注射液合用時(shí)，是加重了清開靈注射液抑制動(dòng)作電位的形成。
　　4.異丙嗪及合用清開靈注射液對(duì)大鼠左心室肌細(xì)胞L型鈣

21、電流的影響:
　　清開靈注射液呈劑量依賴性的阻滯大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣電流，抑制其L型鈣電流50％濃度(IC50)為52.2±10.9 ml/L。異丙嗪對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞的L型鈣電流也有抑制作用，抑制其的50％濃度(IC50)是9.2±1.3μmol/L。異丙嗪在清開靈3.3 ml/L存在的條件下，抑制大鼠L型鈣電流50％濃度(IC50)為7.0±1.0μmol/L，兩組之間存在顯著性差異。
　　5.異丙嗪及合用清開靈注射液對(duì)h

22、Nav1.5電流的影響:
　　異丙嗪濃度依賴性地抑制了hNav1.5電流，其IC50為6.4±1.4μmol/L。異丙嗪在清開靈3.3 ml/L存在條件下，抑制hNav1.5電流50％濃度(IC50)為4.0±0.4μmol/L，兩組之間存在顯著性差異。
　　6.異丙嗪及合用清開靈注射液對(duì)hERG電流的影響:
　　異丙嗪可計(jì)量依賴性的阻滯hERG電流，抑制hERG電流50％的濃度(IC50)為1.6±0.2μmol/L

23、。異丙嗪在清開靈3.3 ml/L存在的條件下，其抑制hERG電流50％濃度(IC50)為1.0±0.2μmol/L，兩組之間存在顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　1.豚鼠心臟的在體和離體實(shí)驗(yàn)?zāi)艽_證清開靈注射液能穩(wěn)定的誘發(fā)緩慢性心律失常。
　　2.在豚鼠心臟的在體實(shí)驗(yàn)中，異丙嗪有減慢其心律失常的作用。在離體乳頭肌的實(shí)驗(yàn)中可以使動(dòng)作電位部分消失。同時(shí)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣電流、hNav1.5以及hERG電流都呈濃度依賴性的抑制

24、，其IC50分別為9.2±1.3μmol/L、6.4±1.4μmol/L、1.6±0.2μmol/L。
　　3.異丙嗪與清開靈注射液的合用并沒有起到救治作用，反而加重了清開靈注射液減慢心率以及顯著延長(zhǎng)P-R間期以及QRS間期和QTc間期的作用，進(jìn)一步加重清開靈致緩慢性心律失常的作用。
　　4.異丙嗪在清開靈3.3 ml/L的存在條件下，對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣電流、hNav1.5以及hERG電流都呈濃度依賴性的抑制，IC50分