基于甘露糖受體的黑靈芝多糖免疫調(diào)節(jié)作用及機制研究.pdf

1、多糖被證實具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤、降血糖、降血脂等多種功能，其中免疫調(diào)節(jié)作用是眾多多糖類物質(zhì)的最基本的作用，該調(diào)節(jié)方式主要通過以下幾個途徑實現(xiàn)：直接或間接激活巨噬細胞、NK細胞和T、B淋巴細胞；促進細胞因子的生成與分泌；激活補體系統(tǒng)；促進抗體產(chǎn)生等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，多糖激活免疫細胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用主要是通過與細胞表面的受體相結(jié)合而介導的。目前發(fā)現(xiàn)的受體主要包括Toll樣受體（TLRs）、甘露糖受體（MR）、樹突狀細胞相關(guān)C型凝集素-

2、1（Dectin-1）、補體受體3（CR3）、清道夫受體（SR）等。多糖與這些受體結(jié)合后可以激活細胞內(nèi)信號通路，進而活化免疫細胞，促進細胞因子的釋放調(diào)節(jié)免疫反應。MR可識別含甘露糖或巖藻糖殘基的多種糖分子，是先天免疫系統(tǒng)中重要的模式識別受體和內(nèi)吞受體，主要存在于巨噬細胞和樹突狀細胞的細胞膜表面，在維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)、識別病原體、誘導細胞因子、抗原遞呈等過程中發(fā)揮重要作用。TLRs則是目前所發(fā)現(xiàn)的受體中與多糖關(guān)系最為密切的一類。
　　黑靈芝

3、既是我國傳統(tǒng)的藥用真菌也是民間常見的食品配料，它具有多方面的生物活性。本實驗室從黑靈芝中分離純化出一種水溶性多糖（PSG-1），綜合現(xiàn)代化學分析方法，解析出了其結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果表明 PSG-1的單糖組成為甘露糖、半乳糖和葡萄糖，摩爾比為1：1.28：4.91。實驗室前期研究已確定 PSG-1具有增強宿主免疫功能的作用，在此基礎(chǔ)上開展 MR的研究對深入了解 PSG-1活性功能與免疫機制，以及基于 MR為靶向的黑靈芝的深度開發(fā)具有重要意義。因

4、此，本實驗探討了PSG-1的免疫調(diào)節(jié)作用與MR的關(guān)系以及在LPS誘導的巨噬細胞中PSG-1激活的TLRs信號轉(zhuǎn)導通路與MR的關(guān)系。主要研究內(nèi)容如下：
　　1、PSG-1對小鼠腹腔巨噬細胞MR的影響：為了探討PSG-1對正常小鼠腹腔巨噬細胞MR的影響，本實驗將20～160μg/mL PSG-1作用巨噬細胞后，用流式細胞儀測定細胞表面MR的表達，RT-PCR檢測巨噬細胞MR的mRNA表達水平；以MR抑制劑甘露聚糖預處理細胞30min后

5、加入PSG-1，用流式細胞儀檢測巨噬細胞的吞噬功能，酶聯(lián)免疫法測定培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β的含量，RT-PCR檢測細胞TNF-α、IL-1β的mRNA表達水平。結(jié)果顯示PSG-1可上調(diào)巨噬細胞表面MR的表達及MR mRNA水平；與單獨PSG-1處理組相比，甘露聚糖預處理可明顯抑制 PSG-1增強的巨噬細胞吞噬功能和誘導細胞分泌IL-1β，對TNF-α的分泌則無影響。結(jié)論：MR能部分介導PSG-1對小鼠腹腔巨噬細胞的

6、免疫調(diào)節(jié)作用。
　　2、PSG-1對LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細胞MR的影響：為了探討PSG-1對LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細胞 MR的影響，本實驗采用流式細胞儀檢測 PSG-1對LPS刺激的巨噬細胞表面MR的表達以及RT-PCR檢測PSG-1對LPS刺激的巨噬細胞MR mRNA的表達水平的影響，結(jié)果證明在LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細胞炎癥模型中，PSG-1對因LPS刺激下調(diào)的MR存在一定的上調(diào)作用。進一步用抗MR抗體處理LPS和PSG

7、-1共同作用的巨噬細胞30min后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗MR抗體可以升高PSG-1抑制的LPS誘導的巨噬細胞吞噬中性紅的能力，且同時顯著升高了PSG-1抑制的LPS誘導的巨噬細胞IL-1β的分泌及IL-1β mRNA的表達效應，但是卻明顯地降低了PSG-1促進的LPS誘導的巨噬細胞IL-10的分泌及IL-10 mRNA的表達效應，另外對PSG-1抑制的LPS誘導的巨噬細胞TNF-α的分泌及TNF-αmRNA表達效應則未顯示出影響。結(jié)論：在LPS刺

8、激的小鼠腹腔巨噬細胞中，PSG-1對細胞的免疫調(diào)節(jié)作用有賴于MR的參與。
　　3、PSG-1對LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細胞 TLR2和TLR4的影響及其與MR在PSG-1介導的免疫調(diào)節(jié)作用中的關(guān)系：本實驗采用Western Blot檢測PSG-1對LPS刺激的巨噬細胞 TLR2和TLR4蛋白表達以及RT-PCR檢測 TLR2和TLR4 mRNA表達水平的影響，實驗結(jié)果表明在LPS刺激的巨噬細胞中，PSG-1可通過作用于TLR4調(diào)節(jié)

9、巨噬細胞的功能?；谝陨蠈嶒灲Y(jié)果，綜合考慮前兩章結(jié)果中PSG-1對MR的影響，采用抗MR抗體封閉MR功能，進一步研究抑制MR的功能后是否能對TLR4所介導的信號途徑產(chǎn)生影響。結(jié)果顯示，LPS刺激的巨噬細胞中，TLR4的MyD88依賴途徑被活化，細胞核內(nèi)NF-κB p65的表達升高，細胞MAPKs的磷酸化水平也升高了；而加入高劑量PSG-1（160μg/mL）共同作用于細胞后，TLR4的表達被下調(diào)，核內(nèi)NF-κB p65的高表達有所降低，

10、MAPKs的磷酸化水平也同時受到了抑制，由此可知PSG-1的確作用于TLR4所介導的信號轉(zhuǎn)導途徑；當細胞預先加入抗MR抗體作用后，與LPS和PSG-1共同作用的細胞相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅對細胞核內(nèi)NF-κB p65由于PSG-1的作用而出現(xiàn)的表達降低有一定的回調(diào)作用，對其他分子的蛋白表達無明顯的影響。結(jié)論：PSG-1對LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細胞的細胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白的表達可能受到TLR4和MR的共同調(diào)節(jié)。
　　綜上所述，P