環(huán)親素A對泡沫細胞功能影響的初步研究.pdf

1、目的：
　　類風濕關節(jié)炎(rheumatoidarthritis,RA)是一種以慢性關節(jié)滑膜炎、關節(jié)損傷和骨破壞為特征的全身系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其發(fā)病機制和病因尚不清楚。多項研究表明，RA患者的病死率較普通人增高約70％左右，多半原因是心血管疾病所導致，而其中動脈粥樣硬化的快速發(fā)展在RA患者心血管疾病所導致的死亡原因中占據首位。以往的研究證實，多種炎性介質、促炎因子及炎細胞參與了RA患者的慢性炎癥反應，導致了動脈粥樣硬化的一系列

2、代謝功能紊亂，從而加速了RA患者動脈粥樣硬化的進展。
　　細胞環(huán)親素A（CyclophilinA，CypA）是大量存在于細胞內的溶質蛋白，免疫親環(huán)素家族成員，是免疫抑制劑環(huán)孢素A（cyclosporinA，CsA）的結合蛋白，具有肽脯氨酰順反式異構酶作用參與細胞內信號轉導、免疫調節(jié)紊亂、促進炎癥反應、蛋白折疊、蛋白活化等多種功能，如RA、自身免疫性疾病、腫瘤等。除了在細胞內發(fā)揮功能之外，CypA同時也作為一種分泌性蛋白分子在心血管

3、疾病的生理及病理發(fā)病機制中發(fā)揮著重要的作用，如血管狹窄、動脈粥樣硬化以及大動脈血管瘤等。CD147分子，又稱為基質金屬蛋白酶誘導因子（extracellularmatrixmetaloproteinaseinducer，EMMPRIN），屬于免疫球蛋白超家族，CypA的受體之一。以往的研究表明，CypA可以通過與靶細胞膜分子CD147相結合促進RA滑膜炎細胞中MMP-2、-9的表達及活性增強，從而進一步加重對關節(jié)軟骨基質的降解、破壞。<

4、br>　　新近文獻報道血小板與CD34+祖細胞共孵育可以分化出泡沫細胞模型，CD34+祖細胞在分化成泡沫細胞的過程中CD147的表達水平上調，那么CypA是否可以與泡沫細胞高表達的CD147相互作用調控泡沫細胞的形成及分化過程來誘導活化MMP的分泌從而加速了動脈粥樣硬化的發(fā)展呢？因此本課題擬在本實驗室先前研究CD147在RA相關動脈粥樣硬化的基礎上進一步探索CypA調控泡沫細胞的形成及分化過程加速了RA相關動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展這一病

5、理過程。
　　方法:
　　1.建立THP-1單核來源泡沫細胞模型
　　將THP-1單核細胞用PMA刺激分化為單核來源的巨噬細胞后,再以氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）作用分化成功的THP-1單核來源巨噬細胞48h,建立泡沫細胞模型，并通過油紅“O”脂質染色法鑒定單核來源的泡沫細胞。
　　2．CypA對泡沫細胞分化過程中黏附力的影響
　　采用流式細胞術檢測不同濃度CypA作用前后THP-1單核來源泡沫細胞分

6、化過程中其細胞表面CD54(ICAM-1)和CD147的表達變化。細胞黏附實驗比較不同濃度CypA和作用前后單核來源泡沫細胞分化過程中黏附能力的變化；同時用CsA、抗CypA抗體c7b8f10和HAb18mAb等分別進行阻斷實驗，分析CD147是否參與CypA對泡沫細胞細胞黏附力的影響。
　　3.CypA對泡沫細胞分化過程中MMP-2、-9的表達活性和侵襲能力的影響
　　不同濃度CypA刺激單核來源泡沫細胞，收集細胞及細胞培

7、養(yǎng)上清，采用細胞侵襲實驗、RT-PCR、明膠酶譜法觀察檢測泡沫細胞分化過程中侵襲力的變化、MMP-2、-9mRNA及蛋白分泌水平的變化；同時用CsA、抗CypA抗體c7b8f10和HAb18mAb等分別進行阻斷實驗，分析CD147是否參與CypA對泡沫細胞MMPs表達及侵襲能力的作用。
　　結果：
　　1．成功建立THP-1單核來源泡沫細胞模型
　　光鏡下觀察對照組細胞(THP-1來源的巨噬細胞)內無紅染顆粒,而處理組

8、（THP-1來源的泡沫細胞）細胞體積增大,細胞質內可見較多的紅染顆粒,顯示細胞內脂質成分增加，油紅“O”特殊染色陽性，符合泡沫細胞形態(tài)學及生物學特征，證明成功建立了THP-1來源的泡沫細胞模型。
　　2．CypA增強泡沫細胞的黏附力及其拮抗劑的抑制作用
　　流式細胞術檢測結果顯示THP-1單核來源泡沫細胞分化過程中其細胞膜表面CD54(ICAM-1)和CD147的表達均較分化前的巨噬細胞和未分化的單核細胞均顯著增高（P<0.

9、05）；經CypA作用后可以進一步增強泡沫細胞膜表面CD54(ICAM-1)分子的表達(P<0.05)。細胞黏附實驗結果亦顯示單核來源的泡沫細胞的黏附率較分化前的單核、巨噬細胞的黏附率均顯著增高(P<0.05)；經CypA處理亦可以顯著增強單核來源泡沫細胞的黏附力（P<0.05）；而針對CypA的拮抗劑CsA、抗CypA抗體c7b8f10和HAb18mAb對單核來源泡沫細胞黏附力均有不同程度的抑制作用，同時也抑制了CypA對黏附率的上調

10、作用（P<0.05）。
　　3.CypA增強泡沫細胞表達MMP-2、-9和侵襲力及其拮抗劑的抑制作用
　　明膠酶譜和RT-PCR實驗結果顯示THP-1單核株來源的泡沫細胞分泌MMP-2，9蛋白和mRNA的表達水平都分別顯著高于分化前的巨噬細胞和未分化的的THP-1單核細胞(P<0.05)；經不同濃度CypA后，單核來源泡沫細胞MMP-2，9的表達水平顯著升高（P<0.05）；而針對CypA的拮抗劑CsA、抗CypA抗體c7b