他克莫司固體脂質(zhì)納米粒制備及理化性質(zhì)研究.pdf

1、研究背景:
　　 他克莫司（tacrolimus，Tac，F(xiàn)K506，商品名Prograf,普樂可復(fù)）是疏水性、中性大環(huán)內(nèi)酯類新型免疫抑制劑，由日本藤澤(Fujisawa)制藥公司于1984年首次從鏈霉菌肉湯培養(yǎng)基中分離得到，目前已能全合成。它的作用機(jī)制和環(huán)孢素相似，都是通過阻斷T細(xì)胞受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑發(fā)揮作用，但免疫抑制方面是環(huán)孢素的10-100倍。由于它的分子量相對較小，可以穿透表皮屏障，為避免全身不良反應(yīng)的發(fā)生，已制成

2、外用制劑治療各種免疫性和炎性皮膚病。在日本，1999年0.1％他克莫司軟膏就被批準(zhǔn)使用。在2000年7月，在加拿大NDS公司進(jìn)行了Ⅲ期臨床試驗(yàn)。美國FDA在2000年12月首次通過局部外用0.1％他克莫司軟膏治療成年人中重度特應(yīng)性皮炎(AD)，使用0.03％他克莫司治療大于2歲的兒童和需要長時(shí)間間歇治療的患者。2005年6月他克莫司軟膏在中國上市，用于治療多種皮膚疾病。外用他克莫司治療特應(yīng)性皮炎和其他T細(xì)胞介導(dǎo)的皮膚病具有良好的效果，并

3、且沒有外用糖皮質(zhì)激素樣的不良反應(yīng)，深受皮膚科醫(yī)師信賴。
　　 外用他克莫司常見的局部不良反應(yīng):燒灼感是最常見的不良反應(yīng)，0.1％的他克莫司軟膏發(fā)生率為31％～61％;0.03％濃度的他克莫司軟膏約為33％-45％，個(gè)別患者用藥后可以引起過敏性接觸性皮炎、酒渣鼻樣肉芽腫性發(fā)疹、Kaposi水痘樣疹、病毒性疣等?？诜四臼歉巍⒛I移植的一線藥物，常見的不良反應(yīng)有腎毒性和神經(jīng)毒性，此外還有高血壓、糖尿病、肥厚性心肌病、急性造血功能停

4、滯、免疫過度抑制、顱內(nèi)感染，以及惡心、嘔吐、低磷血癥、多尿癥、高脂血癥、感覺異常、視力障礙、皮膚異常等癥狀。但絕大多數(shù)外用他克莫司的病人不太可能出現(xiàn)像移植病人那樣的高水平的系統(tǒng)暴露，僅有少數(shù)病人可能會出現(xiàn)低水平的系統(tǒng)暴露，AD是安全性研究最多的疾病，雖然隨著治療受累面積的增大，系統(tǒng)吸收也會增加，但是隨著皮膚炎癥和屏障功能的改善，他克莫司的吸收量也會隨之減少，這可能是外用他克莫司不易產(chǎn)生系統(tǒng)性損害的一個(gè)原因。但基于Tac具有較強(qiáng)的免疫抑制

5、作用和潛在的系統(tǒng)暴露問題，Tac長期使用的安全性問題倍受人們關(guān)注。由于缺乏長期安全性的資料和存在致癌的潛在風(fēng)險(xiǎn)，美國FDA要求外用他克莫司在包裝上加黑框警告，這是FDA關(guān)于藥物副作用最嚴(yán)厲的警告。根據(jù)Becker等病例報(bào)告和文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，在外用他克莫司使用者中，有19例出現(xiàn)癌癥，包括16例成年和3例兒童（小于16歲）。腫瘤出現(xiàn)的時(shí)間在外用他克莫司治療后的21-790天。腫瘤的類型9例為淋巴瘤，10例為皮膚腫瘤，包括鱗狀細(xì)胞癌、皮膚肉瘤和惡性

6、黑色素瘤，大多數(shù)皮膚腫瘤發(fā)生在使用藥物的區(qū)域，腫瘤的發(fā)生和局部使用此藥的持續(xù)時(shí)間和劑量有關(guān)。理論上，使用此藥的時(shí)間越長，系統(tǒng)暴露（血藥濃度）累積水平越高，腫瘤發(fā)生的機(jī)會就越大。
　　 固體脂質(zhì)納米粒(solidlipidnanoparticles，SLN)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的新一代亞微粒給藥系統(tǒng)，它是以固態(tài)的天然或合成的類脂如三酰甘油、卵磷脂等為載體，將藥物包裹在類脂核中經(jīng)不同方法制成的粒徑在10～1000nm之間的固

7、態(tài)膠粒給藥體系。藥物由于被包封于SLN的生理相容耐受性好的固體脂質(zhì)骨架中，從而實(shí)現(xiàn)了更好的控釋和緩釋效果。制備納米粒的材料較多，大致可分為聚合物和脂質(zhì)材料，前者制成的納米粒稱為聚合物納米粒(polymericnanoparticles)，后者稱為固體脂質(zhì)納米粒(solidlipidnanoparticles，SLN)。固體脂質(zhì)納米粒的優(yōu)點(diǎn)有:(1)降低副作用，減少對局部應(yīng)用的刺激性;(2)可同時(shí)增溶不同脂溶性的藥物;(3)降低毒性和溶血

8、作用;(4)藥物分散性好，有利于吸收，提高生物利用度等優(yōu)點(diǎn)。目前常用的固體脂質(zhì)納米粒制備方法有高壓均質(zhì)法、超聲分散法、微乳法和溶劑揮發(fā)法等。而與這些方法相比，乳化蒸發(fā)法制備固體脂質(zhì)納米粒具有所用設(shè)備簡單、操作簡便、適合工業(yè)化生產(chǎn)、制得的固體脂質(zhì)納米粒粒徑大小均勻和有較高的可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，且無需均乳或超聲等高能乳化過程，即實(shí)現(xiàn)了低能乳化，因此是一種值得推廣應(yīng)用的制備方法。
　　 SLN作為局部給藥的主要優(yōu)點(diǎn)是:避免化學(xué)不穩(wěn)定藥物的

9、降解和調(diào)節(jié)藥物的釋放曲線，與口服給藥相比，局部給藥，可減輕系統(tǒng)的毒副作用。同時(shí)，由于SLN脂質(zhì)生理相容性好，對皮膚無刺激;納米粒微小顆粒使其緊密的接觸角質(zhì)層，使SLN具有良好的黏附性，可在皮膚表面形成連貫的具有閉塞效應(yīng)的膜，閉塞效應(yīng)還可增加皮膚的水合作用從而減少水分的散失，隨著納米粒粒徑的變小或SLN局部濃度的升高黏附性增強(qiáng)，從而進(jìn)一步增進(jìn)皮膚的水合作用，提高藥物對皮膚的滲透率。同時(shí)，SLN具有緩控釋作用，在表皮、真皮形成藥物儲庫，增加

10、藥物在皮膚組織中的滯留量，直接持久地對病變細(xì)胞起作用，降低藥物的全身性吸收。國外研究者對固體脂質(zhì)納米粒在經(jīng)皮給藥系統(tǒng)中的應(yīng)用進(jìn)行了深入研究，克霉唑、維生素C棕櫚酸脂、酮康唑、遮光劑、抗紫外線劑、咪唑類抗真菌藥物、輔酶Q10以及抗關(guān)節(jié)炎藥伐地考昔和塞來考昔已被成功制成局部用經(jīng)皮給藥系統(tǒng)，并取得了理想的藥物釋放效果和皮膚靶向作用。
　　 研究目的:
　　 以硬脂酸作為他克莫司經(jīng)皮給藥載體，對其處方組成、制備工藝、形態(tài)、粒徑、

11、包封率、差示掃描量熱、穩(wěn)定性、體外釋放進(jìn)行研究。期望通過這種新型微粒給藥系統(tǒng)用于皮膚局部給藥，減少他克莫司經(jīng)皮使用的副作用，同時(shí)使更多的藥物貯留在皮膚內(nèi)，以增加局部藥物濃度減少系統(tǒng)吸收。
　　 研究方法:
　　 1.處方前工作:本章確立了他克莫司的體外分析方法。經(jīng)紫外掃描確定了藥物的最大吸收波長為220nm，采用高效液相色譜法（HPLC法）測定固體脂質(zhì)納米粒中他克莫司的含量，最終確定檢測條件:色譜柱(:)C18，流動相:

12、乙腈-水-磷酸(700∶300:1)，柱溫:50℃，檢測波長:220nm，進(jìn)樣量:50μl。在此條件下進(jìn)行一系列的標(biāo)準(zhǔn)曲線制備、精密度、回收率、重現(xiàn)性等試驗(yàn)驗(yàn)證HPLC方法適合他克莫司含量的測定。此外進(jìn)行測定了他克莫司在不同介質(zhì)中的溶解度及他克莫司的油/水分配系數(shù)，為后續(xù)制備工藝的選擇提供參考;
　　 2.固體脂質(zhì)納米粒制備工藝的選擇:固體脂質(zhì)納米粒常用的制備方法有微乳法、薄膜-超聲分散法、乳化蒸發(fā)-低溫固化法等。三種方法各有優(yōu)

13、缺點(diǎn)，通過制備方法的比較發(fā)現(xiàn)，乳化蒸發(fā)-低溫固化法適合他克莫司SLN制備;通過考察不同的脂質(zhì)載體、表面活性劑、有機(jī)溶劑的選擇并進(jìn)行正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)篩選最優(yōu)處方。
　　 3.他可莫司固體脂質(zhì)納米粒包封率測定的研究。分別采用魚精蛋白法，低溫高速分離、葡聚糖微柱凝膠法測包封率，最終確定適合本實(shí)驗(yàn)的方法為微柱離心法;并對微柱離心法進(jìn)行一系列的驗(yàn)證:葡聚糖凝膠G-50對游離他克莫司的吸附、對空白脂質(zhì)體的吸附及對固體脂質(zhì)納米粒樣品中他克莫司的吸

14、附。該方法準(zhǔn)確可靠、快速簡單、專屬性好，適用于他克莫司SLN包封率的測定。
　　 4.對他克莫司SLN形態(tài)、粒徑的觀察及差示掃描量熱法、X-衍射確定最后處方后藥物在脂質(zhì)體中的形態(tài)。
　　 5.他克莫司SLN穩(wěn)定性研究:分別取3批制備好的他克莫司SLN樣品，放置于室溫和4℃冰箱，0、30、60天觀察樣品的外觀及粒徑的測量;將FK506-SLNs混懸液于15000rpm離心30分鐘，觀察有無藥物結(jié)晶或脂質(zhì)沉淀析出。
　

15、　 6.取FK506-SLN混懸液及相同濃度的FK506原料藥10ml，置于透析袋中(截留分子量12000-14000)，兩端夾緊后置200ml帶塞錐形瓶中，加入釋放介質(zhì)(PH7.4PBS)100ml，將錐形瓶避光放入（37±2）℃恒溫?fù)u床中，每分鐘振蕩80次，于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60和72h時(shí)取樣2ml，然后補(bǔ)加相同體積的PBS。將樣液經(jīng)0.45μm濾膜過濾，經(jīng)HPLC測藥物峰面積，并計(jì)算其濃

16、度。按照公式Qn=Cn*V0+(C1+C2+C3+……+Cn-1)*V計(jì)算累積擴(kuò)散釋藥量，并計(jì)算累積釋藥百分率，繪制體外釋放曲線。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 采用SPSS13.0軟件和EXCEL進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以(X)±SD表示，計(jì)算RSD值，采用[L27(34)]正交設(shè)計(jì)進(jìn)行方差分析，當(dāng)P≦0.05時(shí)，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果::
　　 1.確立了他克莫司的體外分析方法。經(jīng)紫外掃描確定了

17、藥物的最大吸收波長為220nm，采用HPLC法測定固體脂質(zhì)納米粒中他克莫司的含量，藥物在1.6-80μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，得線性方程:A=32.2465C-1.1367(r=0.9998)，最低檢出限為:0.1μg/ml，日內(nèi)、日間精密度RSD均小于1％，平均回收率為99～100.03％之間，方法簡便、可行。
　　 2.測定了他克莫司在不通介質(zhì)中的溶解度，為后續(xù)制備工藝的選擇提供參考。他克莫司在生理鹽水、0.1MNaOH

18、、Birj78和油酸中的溶解度分別為0.9mg/ml、28.6mg/ml、1.8mg/ml和0.64mg/ml。結(jié)果表明他克莫司在油中不溶，在生理鹽水和表面活性劑溶液中微溶，在0.1MNaOH中略溶。
　　 3.測定了他克莫司的油/水分配系數(shù)，其在PH為7.4的PBS中油/水分配系數(shù)為0.308，親脂性較差，不易透過脂質(zhì)屏障，因此藥物本身透皮滲透較差。
　　 4.確定他克莫司SLN的制備方法:乳化蒸發(fā)-低溫固化法，通過對

19、單因素及正交設(shè)計(jì)的考察，最終制得穩(wěn)定的他克莫司SLN乳液，測得粒徑(134±18)nm，分散指數(shù)0.35，粒度分布窄;其表面帶負(fù)電，zeta電位為（-30.8±1.44）mV，包封率為88.74％，投射電鏡粒子成圓形或橢圓形，大小較均勻，無團(tuán)聚現(xiàn)象，由DSC和X-衍射得出他克莫司以無定形的形態(tài)而非結(jié)晶狀態(tài)包封于納米粒中，在4℃存放60天的納米粒粒徑及包封率無明顯變化變化，F(xiàn)K506-SLNs混懸液于15000rpm離心30分鐘，離心后無

20、分層，無藥物結(jié)晶及脂質(zhì)析出現(xiàn)象
　　 5.確定使用葡聚糖G-50微柱離心法分離未包括的藥物測包封率。葡聚糖凝膠G-50對游離他克莫司的吸附游離藥物吸附率為94.9％～97.5％。微柱對空白脂質(zhì)體的回收率=C(微)往后/C(微)柱前.計(jì)算得回收率分別為91.4％、93.5％、96.8％和99.7％，RSD分別為0.76％、2.53％、1.28％和0.59％;微柱對固體脂質(zhì)納米粒樣品中他克莫司的吸附率94.93-97.52％，RSD

21、值0.31-0.9％。方法準(zhǔn)確可靠，快速簡單，測定固體脂質(zhì)納米粒包封率所需時(shí)間短，專屬性好，樣品用量少且稀釋倍數(shù)小，適用用他克莫司SLN包封率的測定。
　　 6.他克莫司SLN體外釋放實(shí)驗(yàn):在前8h他克莫司原料藥約96％藥物釋放出來，而他克莫司SLN中的他克莫司僅有55％釋放出來，隨后FK506-SLN表現(xiàn)為持續(xù)緩慢釋放，在72h累計(jì)釋放量約為86％。
　　 結(jié)論:
　　 1.他克莫司體外分析方法方法簡便、準(zhǔn)確可

22、行;他克莫司在水中的溶解度很低，要經(jīng)皮給藥，必須通過一定的方法增大他克莫司的溶解度，才能實(shí)現(xiàn)較好的透皮性能;他克莫司的油/水分配系數(shù):其在PH為7.5的PBS中油/水分配系數(shù)為0.308，親脂性較差，不易透過脂質(zhì)屏障，因此藥物本身透皮滲透較差。
　　 2.通過對多種包封率測量方法的比較，最后選擇葡聚糖G-50微柱離心法分離未被包括的游離藥物進(jìn)一步測定包封率，方法準(zhǔn)確可靠，快速簡單，測定固體脂質(zhì)納米粒包封率所需時(shí)間短，專屬性好，樣