蜜蜂球囊菌cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及胞外酶的定性研究.pdf

1、蜜蜂白堊病(bee chalkbrood disease)是由蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)引起的真菌性傳染病，主要感染蜜蜂幼蟲。白堊病是我國(guó)養(yǎng)蜂業(yè)中潛在病害之一，影響著我國(guó)養(yǎng)蜂業(yè)的發(fā)展。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)蜜蜂球囊菌的研究主要集中在病原的生物學(xué)特性、最適培養(yǎng)條件、發(fā)病流行規(guī)律、病理學(xué)、病情的診斷等方面，由于蜜蜂球囊菌的致病機(jī)理不明，不能在生產(chǎn)中有效的預(yù)防和治療蜜蜂白堊病。 本研究采用Stratagene公司的ZAP E

2、epress R cDNA Synthesis Kit and ZAP Express R cDNA Gigapack R III Gold Cloning Kit試劑盒，構(gòu)建了蜜蜂球囊菌cDNA文庫(kù)。文庫(kù)滴度測(cè)定為106 pfu·mL-1，擴(kuò)增后的滴度是109 pfu·mL-1；噬菌體的轉(zhuǎn)化后，藍(lán)白斑篩選單菌落，重組率達(dá)到90％。這為后續(xù)工作的進(jìn)行打下良好的基礎(chǔ)。昆蟲中腸圍食膜主要由蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)和糖類等組成。蜜蜂球囊菌通過分泌胞外蛋

3、白酶、幾丁質(zhì)酶、酯酶和淀粉酶等破壞蜜蜂幼蟲中腸圍食膜侵染蜜蜂；本試驗(yàn)對(duì)幾種常見的蛋白酶、酯酶和淀粉酶分別進(jìn)行活性染色和銀染，結(jié)果顯示：蜜蜂球囊菌能夠胞外分泌蛋白酶、酯酶和淀粉酶。在SDS-PAGE條件下，蛋白酶活性染色有兩條條帶，分子量為37.0 kDa和110.0 kDa；酯酶活性染色鑒定出三條帶，分子量是14.1 kDa、20.1 kDa、29.0 kDa。在PAGE條件下，蛋白酶有兩條條帶，分子量為48.0 kDa和94.0 kD

4、a；酯酶活性鑒定出一條帶，分子量是35.0kDa淀粉酶活性鑒定出至少三條帶，分子量為90.0 kDa、97.2 kDa和大于97.0 kDa。 此外，本研究還對(duì)球囊菌分泌幾丁質(zhì)酶的情況進(jìn)行了探索。利用蜜蜂球囊菌胞外分泌物(幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白)結(jié)合膠體幾丁質(zhì)(N-乙酰葡糖氨)，設(shè)計(jì)不同結(jié)合時(shí)間、不同緩沖體系，進(jìn)行結(jié)合蛋白試驗(yàn)，然后結(jié)合后進(jìn)行Loading buffer和Calcofluor(M2R)處理；pH 7.4條件下結(jié)合6 d，