乙肝耐藥患者血清microRNA差異表達(dá)的研究.pdf

1、目的:探討microRNA(miRNA)在HBV感染者與健康者，耐藥突變者與無突變敏感者血清中的差異表達(dá)，判斷miRNA用于乙肝耐藥突變的診斷價(jià)值。
　　方法:首先，我們根據(jù)權(quán)威文獻(xiàn)報(bào)道篩選出與乙肝感染相關(guān)性最高的兩種miRNA——miR-122-5p和miR-125b-5p，收集乙肝感染且HBV-DNA定量＞5.00×102IU/ml（本研究所采用的試劑盒HBV-DNA最低檢出限為5.00×102IU/ml）的入院患者49名的血

2、清樣本作為實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組樣本均來自于四川省瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院。于四川省瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢中心篩選健康體檢者21名的血清樣本作為對(duì)照組，對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)為HBV-DNA定量＜5.00×102IU/ml且乙肝兩對(duì)半定量檢測(cè)全在正常參考范圍內(nèi)。所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象無其它類型肝炎病毒的感染，排除酒精性肝病、自身免疫性肝病、代謝性肝病、藥物性肝病、隱源性肝病、血吸蟲性肝病、遺傳性肝病等;無腎臟、血液腫瘤等可能會(huì)影響血清水平的疾病，并且無血液制品輸注史;

3、入院后經(jīng)CT或B超檢查排除肝癌的可能;然后，我們提取實(shí)驗(yàn)組血清HBV-DNA和所有樣本血清總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，檢測(cè)RNA的OD值以判斷其純度，檢測(cè)結(jié)果表明所提取的RNA質(zhì)量良好，無污染，無降解，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。接著我們利用反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組的乙肝耐藥突變，檢測(cè)得到實(shí)驗(yàn)組耐藥突變結(jié)果分為rt204I、 rt204V、rtL180M、 rt204V+rtL180M以及未突變的“野生型”五類。最后，我們以ce

4、l-miR-39-3p為外參，檢測(cè)宿主miR-122-5p和miR-125b-5p的相對(duì)表達(dá)水平（我們委托廣州銳博生物技術(shù)有限公司對(duì)所有引物進(jìn)行合成、純化和鑒定），檢測(cè)結(jié)果通過SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，探討:1.患者感染HBV是否影響miR-122-5p和miR-125b-5p的表達(dá)水平;2.耐藥突變的出現(xiàn)是否影響miR-122-5p和miR-125b-5p的表達(dá)水平;3.年齡是否影響miR-122-5p和miR-125b-5p

5、的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1.表3中，耐藥突變組和無突變野生組miR-122-5p和miR-125b-5p的均數(shù)M均大于健康對(duì)照組的M值，表4中，HBV感染組VS健康對(duì)照組，miR-122-5p和miR-125b-5p的P值均＜0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此說明患者感染HBV后miR-122-5p和miR-125b-5p的值將顯著升高;2.表3中，耐藥突變組miR-122-5p和miR-125b-5p的均數(shù)M均大于無突變野生組的

6、M值，表4中，耐藥突變組VS無突變野生組，miR-122-5p和miR-125b-5p的P值均＜0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此說明，耐藥突變的出現(xiàn)將導(dǎo)致miR-122-5p和miR-125b-5p的值顯著升高;3.從散點(diǎn)圖圖6～圖11中可以看出，無論是HBV耐藥突變組還是無突變野生組，亦或是健康對(duì)照組，年齡的變化與miR-122-5p和miR-125b-5p的相對(duì)定量值成正相關(guān)，0＜γ＜1，由此說明，隨著年齡的增長，miR-122-