脂肪干細胞來源施萬細胞在大鼠腦損傷中的應用.pdf

1、背景:施萬細胞(schwann cells,SCs)在周圍神經(jīng)系統(tǒng)軸突損傷修復中起著至關重要的作用。隨著組織工程技術的發(fā)展,部分學者提出用施萬細胞來修復中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。但是由于施萬細胞為終末細胞,其來源和增殖能力有限、體外培養(yǎng)較困難,故很難獲得足夠數(shù)量的細胞,并不能完全滿足種子細胞的要求和特點。脂肪干細胞(adipose derived(Mesenchymal)stem cells,ADSCs)具有來源廣,取材方便,含量較豐富,在體

2、外較易培養(yǎng)增殖等優(yōu)點,使得它被越來越多人重視,成為新的組織工程種子細胞來源。
　　目的:本試驗通過對SD(Sprague-Dawley)大鼠腹股溝脂肪的提取和培養(yǎng),獲得脂肪干細胞,并體外誘導其分化成類施萬細胞。然后用脂肪干細胞來源施萬細胞移植治療運動皮層損傷大鼠偏癱模型,并初步探討其對腦損傷修復的機制。
　　方法:采用酶消化法,取SD大鼠腹股溝脂肪組織,以加有10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的低

3、糖α-MEM培養(yǎng)基,在5％CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),傳代。采用第3-5代亞融合狀態(tài)細胞,通過β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME),全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA),血小板衍生因子(platelet-derived growth factor,PDGF),福斯高林(forskolin,FSK),堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth

4、factor,bFGF),神經(jīng)膠質生長因子-2(glial growth factor-2,GGF-2)等的序貫作用下,誘導細胞分化。并行免疫熒光檢測施萬細胞的特異性標志物膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP),S-100和P75。于此同時,在顯微鏡下?lián)p毀大鼠左側運動皮層,制作出對側偏癱大鼠模型。然后將獲得的分化細胞移植到偏癱大鼠受損腦皮層局部,觀察試驗大鼠的運動功能恢復情況并分別采

5、用Longa評分和Faden評價運動功能恢復程度。進一步,我們對部分大鼠海馬區(qū)組織進行nestin染色,了解移植后內源性神經(jīng)干細胞的變化。對部分大鼠受損側腦組織進行Western Blotting,檢測其中神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF),腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF),caspase3,Nestin及Neurocan的表達,以定量了解移植

6、后受損環(huán)境中這些因子的表達情況。此外,利用轉染技術將綠色熒光蛋白標記移植細胞,移植后用GFAP標記反應性膠質細胞,從而觀察移植細胞與膠質疤痕之間的關系。最后采用SPSS18.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。
　　結果:成功從SD大鼠腹股溝脂肪組織中分離出ADSCs,在體外培養(yǎng)獲得增殖和傳代。誘導分化出的類施萬細胞,呈現(xiàn)典型施萬細胞形態(tài),并表達施萬細胞特異性標志物GFAP,S100以及P75。依照我們的方法搗損運動皮層,能建立對側不

7、全偏癱模型。將ADSCs來源施萬細胞移植后,發(fā)現(xiàn)ADSCs-sCs能夠大幅度改善偏癱大鼠術后運動功能。進一步的研究發(fā)現(xiàn),ADSCs-SCs可以動員內源性神經(jīng)干細胞增殖,促進神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF,BDNF的分泌,抑制凋亡,減少膠質疤痕形成,減少抑制性因子Neurocan的分泌。結果與對照組比均有統(tǒng)計學意義。
　　結論:1.ADSCs-SCs移植大大改善運動皮層損傷的偏癱大鼠模型術后運動功能。2.ADSCs-SCs在體內可以促進內源性神