PK2對大鼠睪丸免疫細胞亞群及誘生型一氧化氮合酶表達影響的初步研究.pdf

1、本文從以下幾個方面進行論述。
　　第一部分 PK2對大鼠睪丸免疫細胞亞群和iNOS的影響
　　目的：研究PK2對睪丸免疫細胞亞群和iNOS的影響，初步探討PK2對睪丸免疫微環(huán)境的影響。
　　方法：將PK2蛋白（分為50pmol、100pmol、300pmol）通過睪丸網(wǎng)注射到成年SD大鼠睪丸，對照組給予生理鹽水，每組12只，一周后取睪丸做HE染色。各組睪丸經(jīng)膠原酶Ⅰ消化，淋巴細胞分離液分離后，流式細胞術檢測PK2注射組

2、睪丸間質(zhì)免疫細胞亞群的變化。免疫組織化學法檢測升高組iNOS表達情況。
　　結果：隨著PK2蛋白劑量的增加，睪丸形態(tài)學呈現(xiàn)不同程度的改變，間質(zhì)內(nèi)血管和細胞增多，生精上皮萎縮，脫落，尤其以300pmol表現(xiàn)最明顯。流式細胞術顯示隨著劑量的增加，睪丸間質(zhì)內(nèi)免疫細胞數(shù)量增多，尤其以CD8+淋巴細胞、ED1+ED2-、ED1-ED2+、ED1+ED2+巨噬細胞數(shù)量增加明顯，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。iNOS表達水平升高

3、,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論：PK2影響睪丸間質(zhì)內(nèi)的免疫細胞數(shù)量及亞群，增加iNOS表達水平，影響睪丸免疫平衡。
　　第二部分 PK2siRNA睪丸內(nèi)干擾效果
　　目的：PK2表達質(zhì)粒與化學合成的PK2干擾序列共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，篩選出PK2的有效干擾序列，觀察其在乳鼠睪丸內(nèi)的干擾效果。
　　方法：針對大鼠PK2mRNA序列設計三條不同的干擾序列（siPK2-S1，S2，S3），

4、通過將Cy3熒光標記的對照siRNA稀釋成20nM、30nM、50 nM和100nM四個濃度梯度，確定最佳轉(zhuǎn)染濃度。在陽離子脂質(zhì)體Lipfectamine2000介導下，將PK2表達質(zhì)粒與三段siRNA序列共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，按實驗要求分為陽性對照組（加PK2表達質(zhì)粒，P）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性siRNA序列，N）、實驗組（S1，S2，S3）。采用實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)然后48h各組細胞PK2mRNA表達情況。采用Clontech

5、試劑盒檢測轉(zhuǎn)染72h后 PK2蛋白表達情況，確定最有效的干擾序列。最有效干擾序列經(jīng)FAM修飾后通過睪丸網(wǎng)注射到生后12天的雄性SD乳鼠睪丸，對照組注射陰性對照序列，每組6只。一周后取睪丸做HE染色。RT-PCR檢測PK2mRNA在睪丸中的表達情況。免疫組織化學檢測PK2蛋白表達情況。
　　結果：Cy3-siRNA20nM組可見微弱的紅色熒光，隨著Cy3-siRNA濃度的增加熒光強度增強，50nM大多數(shù)細胞熒光強度最強，選定50nM