解淀粉芽孢桿菌SQR9生物膜形成和根際定殖分子機(jī)理研究.pdf

1、黃瓜土傳枯萎病是黃瓜連作生物障礙的主要病害之一，嚴(yán)重影響黃瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，研究利用生物防控為主導(dǎo)的綜合防控具有重要意義。解淀粉芽孢桿菌SQR9是本實(shí)驗(yàn)室從黃瓜種植發(fā)病區(qū)的健康植株根際分離的一株根際促生菌，能強(qiáng)烈抑制土傳枯萎病病原真菌黃瓜?；停‵usarium oxysporum f.sp.cucumerinum J.H.Owen，F(xiàn)OC），在盆栽和大田試驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著的促生和生防效果。本文緊緊圍繞生物防控的兩個(gè)主要部分:拮抗機(jī)理和根際定

2、殖機(jī)理開展了一系列的研究。首先研究了SQR9在實(shí)驗(yàn)室條件下拮抗黃瓜枯萎病病原真菌尖孢鐮刀菌的機(jī)理，發(fā)現(xiàn)一種抗生素物質(zhì)同時(shí)影響了SQR9拮抗活性和生物膜的形成;然后通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，研究了這種抗生素物質(zhì)影響SQR9生物膜形成和根際定殖行為的機(jī)理;最后利用分子生物學(xué)手段，研究了全局性調(diào)控因子DegU影響SQR9生物膜形成、根際定殖能力和主要抗真菌抗生素產(chǎn)量的內(nèi)在規(guī)律;同時(shí)，研究了黃瓜根際影響SQR9生物膜的環(huán)境信號(hào)，將成熟的芽孢桿菌生物膜形成

3、機(jī)制與根際定殖機(jī)理結(jié)合。主要研究結(jié)果有以下幾點(diǎn):
　　1.通過液質(zhì)聯(lián)用的方法鑒定出SQR9發(fā)酵液兩種脂肽類抗生素bacillomycin D和fengycin有拮抗黃瓜枯萎病病原真菌活性，基因定點(diǎn)敲除了bacillomycinD和fengycin的合成基因bamD（SQR9M1）和fenA（SQR9M2）后，SQR9M2的發(fā)酵液仍然對(duì)黃瓜枯萎病病原真菌有強(qiáng)烈的拮抗活性（抑制率為96％），與野生型SQR9發(fā)酵液類似（抑制率為98％）

4、，而SQR9M1的發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病病原真菌僅剩40％的抑制率。證明bacillomycin D是SQR9拮抗黃瓜枯萎病病原真菌的主要活性物質(zhì)。
　　2.首次發(fā)現(xiàn)bacillomycin D能影響SQR9生物膜形成和根際定殖過程，定性和定量的結(jié)果表明突變體SQR9M1在生物膜形成前期，其生物膜形成能力顯著低于野生型，外源添加液相收集的bacillomycin D后生物膜形成能力恢復(fù)。運(yùn)用熒光定量PCR的方法證明，在SQR9生物膜形

5、成前期bacillomycin D突變體影響了生物膜相關(guān)基因yqxM、kinC和epsD的表達(dá)，外源加入液相收集的bacillomycin D后生物膜相關(guān)基因的表達(dá)均能恢復(fù)，但外源添加鉀離子沒有作用。深入的研究發(fā)現(xiàn)，bacillomycin D影響SQR9生物膜的機(jī)理和另一種脂肽類抗生素surfactin影響生物膜的機(jī)理不同，存在新的機(jī)制。黃瓜根際定殖的結(jié)果表明突變體SQR9M1在黃瓜根際定殖前期，定殖數(shù)量顯著低于野生型SQR9和突變體

6、SQR9M2，同樣外源添加液相收集的bacillomycin D后突變體SQR9M1的根際定殖能力恢復(fù)。
　　3.通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析了突變體SQR9M1和野生型SQR9生物膜形成24h時(shí)基因的表達(dá)差異。分析結(jié)果表明，一共有1261個(gè)基因表達(dá)發(fā)生改變，其中574個(gè)基因上調(diào)（P＜0.01），687個(gè)基因下調(diào)（P＜0.01）。從基因功能上看，功能明確的基因約占全部差異基因數(shù)量的70％,變化最大的基因功能類群是無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。在這部分

7、基因中，大量的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)被顯著調(diào)控，特別是與鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，有9個(gè)基因被顯著下調(diào)，幾乎包含了在芽孢桿菌中已報(bào)道的所有鐵運(yùn)輸?shù)幕?，其中包括FhuBGC、FeuABC和YfmCDEF三個(gè)鐵ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。選取了部分鐵離子ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成基因和生物膜相關(guān)基因進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果一致。低濃度的鐵離子能促進(jìn)SQR9生物膜的形成，而高濃度的鐵離子抑制SQR9生物膜的形成。外源添加適當(dāng)濃度的鐵離子后，能恢

8、復(fù)突變體SQR9M1形成生物膜的能力。
　　4.根據(jù)SQR9的全基因組序列及其注釋，找到了五個(gè)鐵離子運(yùn)輸ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白:YwbMNL、YfmCDEF、FhuBGC、YfiYZ和FeuABC。將這五個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因定點(diǎn)敲除后，首次發(fā)現(xiàn)突變體△feuBC和△yusV（基因feuBC和yusV分別是鐵離子ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)FeuABC的Permease和ATPase）顯著影響了菌落形態(tài)和生物膜形成。突變體△feuBC的菌落始終非常水潤

9、，和野生型SQR9培養(yǎng)12 h時(shí)的菌落形態(tài)一致，即使在培養(yǎng)后期，菌落表面也不能形成褶皺狀的高級(jí)結(jié)構(gòu)。突變體△yusV前期和突變體△feuBC一樣，菌落非常水潤，但到了培養(yǎng)后期，其菌落部分地方形成了類似野生型菌落后期的高級(jí)結(jié)構(gòu)，菌落形態(tài)處于突變體△feuBC和野生型SQR9的中間狀態(tài)。定性和定量的結(jié)果表明，突變體△feuBC和△yusV失去了大部分形成生物膜的能力，特別是突變體△feuBC，幾乎不能形成生物膜。定量PCR的結(jié)果表明，外源添

10、加bacillomycinD和10μM氯化鐵后，SQR9內(nèi)鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)基因和生物膜形成相關(guān)基因有相同的變化規(guī)律（都顯著上調(diào)），突變體△feuBC和△yusV內(nèi)的鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)基因和生物膜形成相關(guān)基因失去了響應(yīng)bacillomycin D和10μM氯化鐵的能力。生物膜調(diào)控基因突變體△sinl和△tasA在菌落形態(tài)和生物膜形成能力上分別和突變體△yusV和△feuBC相似。定量PCR的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體△yusV和△feuBC中TasA蛋白的合成基

11、因yqxM顯著下調(diào)，這是突變體△yusV和△feuBC影響菌落形態(tài)和生物膜形成的主要原因。成功異源表達(dá)了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FeuABC的基質(zhì)綁定蛋白FeuA，發(fā)現(xiàn)蛋白FeuA能和脂肽類抗生素bacillomycin D特異性結(jié)合，推測(cè)bacillomycin D是通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FeuABC影響生物膜形成。
　　5.成功構(gòu)建了SQR9不同DegU磷酸化水平的的三株衍生菌:SQR9M4（低磷酸化水平），SQR9Q（中等磷酸化水平）和S

12、QR9SUQ（高磷酸化水平）。在MSgg固體培養(yǎng)基上，隨著調(diào)控蛋白DegU磷酸化水平的升高，菌落的褶皺和空間結(jié)構(gòu)都變得更加復(fù)雜。突變體SQR9M4的菌落比較平滑，幾乎看不到褶皺，而菌株SQR9SUQ的菌落褶皺復(fù)雜，空間結(jié)構(gòu)豐富，菌落呈現(xiàn)類似火山口形狀的堆積，縱向高度比SQR9和SQR9M4的菌落顯著增加，說明調(diào)控蛋白DegU磷酸化水平影響了SQR9菌落的空間結(jié)構(gòu)。在MSgg液體培養(yǎng)基中，隨著調(diào)控蛋白DegU磷酸化水平的升高，生物膜形成能

13、力也逐步增強(qiáng)。突變體SQR9M4形成生物膜的能力顯著降低，表面幾乎沒有褶皺。菌株SQR9SUQ的生物膜形成能力最強(qiáng)，結(jié)構(gòu)緊密，表面褶皺豐富。根際定殖結(jié)果表明，隨著調(diào)控蛋白DegU磷酸化水平的升高，菌株根際定殖的能力顯著提高。分離純化并鑒定了SQR9發(fā)酵液中六種抗生素類物質(zhì)bacillomycinD、fengycin、surfactin、macrolactin、difficidin和bacillaene。定量PCR和HPLC的結(jié)果表明De

14、gU磷酸化水平最高的菌株SQR9SUQ中bacillomycin D和difficidin這兩個(gè)抗生素的產(chǎn)量顯著高于菌株SQR9M4，隨著DegU磷酸化水平的增高，這兩個(gè)物質(zhì)的產(chǎn)量也隨之增加。DegU磷酸化水平最低的菌株SQR9M4中macrolactin和bacillaene的產(chǎn)量相比于野生型SQR9和菌株SQR9SUQ都顯著提高，隨著DegU磷酸化水平的升高，這兩個(gè)物質(zhì)的產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)。Fengycin和surfactin這兩個(gè)脂肽

15、類抗生素的產(chǎn)量和DegU磷酸化水平?jīng)]有顯著關(guān)系。盆栽試驗(yàn)證實(shí)，DegU磷酸化水平最高的菌株SQR9SUQ因?yàn)楦H定殖能力強(qiáng)并且bacillomycin D產(chǎn)量高，所以具有較好的防控黃瓜枯萎病的能力。
　　6.在MSNc培養(yǎng)基中，SQR9生物膜形成能力顯著高于枯草芽孢桿菌168，3610和解淀粉芽孢桿菌FZB42。黃瓜根系分泌物和根系細(xì)胞提取物都能誘導(dǎo)SQR9的生物膜形成。突變體△sinI和△spo0A喪失了感知根系細(xì)胞提取物的能力