群感信號AI--2對根際促生解淀粉芽孢桿菌SQR9的成膜和運動性影響的分子機(jī)理研究.pdf

1、植物根際促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPRs)是一類能在植物根際存活定殖并具有促生或防控土傳病害能力的有益微生物，例如Bacillus spp.，Streptomyces spp.，Pseudomonas spp.，和Burkholderiaspp等。近年來，PGPR菌株因其環(huán)境友好、安全無毒等優(yōu)點作為微生物肥料在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中逐漸得到廣泛的應(yīng)用，在促進(jìn)作物生長及防控土傳病害等方面取得

2、了良好的效果。微生物在根際的成膜和定殖受多種因素影響，包括細(xì)菌的鞭毛/運動性、趨化性、多糖和植物根系分泌物等。這些影響因素與多種信號物質(zhì)參與的調(diào)控相關(guān)，包括細(xì)胞外信號，如根系分泌物中的多種菌-植互作信號物質(zhì)，還有細(xì)胞自身產(chǎn)生的多種調(diào)控信號，如細(xì)胞自身產(chǎn)生的群體感應(yīng)(quorum-sensing，QS)信號物質(zhì)。
　　解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）SQR9是本課題組從生長良好的黃瓜根際土中獲得

3、的一株植物根際有益菌。本文主要探究群體感應(yīng)信號分子AI-2對根際促生解淀粉芽孢桿菌SQR9的成膜和運動性影響的分子機(jī)理。首先，通過基因敲除手段得到無AI-2產(chǎn)生的luxS基因的突變體(SQR9-△luxS)，通過結(jié)晶紫測定生物膜方法與swimming和swarming法研究了與野生型SQR9相比較，SQR9-△luxS在細(xì)胞膜形成、運動性方面的變化;其次，用硫酸蒽酮滴定法測定了SQR9-△luxS胞外多糖(Extracellular P

4、olysaccharides，EPS)含量的變化;然后，用綠色熒光蛋白(GreenFluorescent Protein，GFP)對野生型、突變株和互補(bǔ)株標(biāo)記，通過平板計數(shù)法和激光共聚焦熒光顯微鏡觀察各菌株在黃瓜和番茄根際原位定殖情況;再者，對不同時間點的野生型和突變體SQR9-△luxS進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，通過比較測序結(jié)果中與生物膜或者運動性等相關(guān)基因的變化區(qū)別試推斷出生物膜等調(diào)控路徑;最后，結(jié)合其他微生物AI-2分子受體蛋白相關(guān)信息預(yù)

5、測SQR9中AI-2分子的受體蛋白，并進(jìn)行一系列驗證實驗，最后找出群感信號AI-2對根際促生解淀粉芽孢桿菌SQR9的成膜和運動性影響的分子機(jī)理。主要研究結(jié)果有以下幾點:
　　1.通過基因敲除手段得到無AI-2產(chǎn)生的SQR9-△luxS，并成功互補(bǔ)，得到互補(bǔ)菌株C-△luxS;
　　2.對SQR9-△luxS的生物膜，運動性和EPS進(jìn)行測定，與野生型SQR9相比較，突變體SQR9-△luxS的生物膜形成顯著增加，運動性明顯增加

6、，胞外多糖產(chǎn)生增多;
　　3.對野生型SQR9和SQR9-△luxS進(jìn)行GFP標(biāo)記，并對SQR9-△luxS-gfp菌株進(jìn)行互補(bǔ)，得到被標(biāo)記的互補(bǔ)菌株C-△luxS-gfp;接標(biāo)記菌株于黃瓜和番茄根際后，平板計數(shù)發(fā)現(xiàn)SQR9-△luxS-gfp接種的植株根際的菌體數(shù)目為3.05*106/g，多于SQR9-gfp（1.6*106/g）和C-△luxS-gfp（1.85*106/g）接種的植株。隨著外源添加AI-2分子的濃度增多，菌體

7、定殖數(shù)量明顯減少。激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察菌體定殖情況基本和平板計數(shù)法一致。
　　4.轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，在LB培養(yǎng)基上，突變體SQR9-△luxS和野生型之間的基因表達(dá)譜差異主要表現(xiàn)在對數(shù)生長末期，而且這些差異基因包含與生物膜形成，鞭毛合成（運動性），糖轉(zhuǎn)運蛋白等，尤其是發(fā)現(xiàn)AI-2對SQR9的一些次生代謝途徑也具有調(diào)控作用。在M9-甘露醇培養(yǎng)基上的數(shù)據(jù)顯示突變體SQR9-△luxS和野生型之間的基因表達(dá)譜差異也主要表現(xiàn)在對數(shù)生長