碳離子硅橡膠改性材料的表面性能及其細(xì)胞相容性評(píng)價(jià).pdf

1、研究背景和目的：
　　在整形外科領(lǐng)域,主要依靠植入軟組織填充材料來(lái)修復(fù)體表組織器官的畸形或缺損。硅橡膠(Siliconerubber,SR)因其具有良好的理化穩(wěn)定性及加工性能,目前仍是臨床上最常用的軟組織填充材料。但SR材料表面呈現(xiàn)強(qiáng)烈的疏水性,使其與人體組織親和力較差,可導(dǎo)致一系列臨床副反應(yīng)。因此,選擇合適的改性處理方式對(duì)硅橡膠材料進(jìn)行改性,不僅可以提高其臨床治療效果,而且對(duì)于研究細(xì)胞生物學(xué)行為與材料學(xué)特性之間的關(guān)系都有著意義。

2、據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,在對(duì)硅橡膠進(jìn)行表面改性的研究方法中,有接枝共聚、仿生涂層等方法,但因均存在一些問(wèn)題,限制了硅橡膠的表面改性效果。如:接枝共聚法,是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)在聚合物活化的基礎(chǔ)上引入特定化學(xué)基團(tuán),整個(gè)過(guò)程不僅步驟繁瑣,而且形成的化學(xué)基團(tuán)不穩(wěn)定等因素影響了其改性效果;仿生涂層法,是通過(guò)噴涂、濺射等方法,在保持材料本身特性的基礎(chǔ)上,覆上一層生物活性物質(zhì)在材料表面,這種改性方法也存在步驟較為繁瑣、難控制操作條件等問(wèn)題,限制了它的推廣應(yīng)用。

3、　　于是,我們?cè)谇捌诠ぷ骰A(chǔ)上,嘗試將離子注入技術(shù)用于有機(jī)高分子材料表面改性。離子注入技術(shù)以往多用于金屬與合金材料的改性,它可選擇不同的離子源進(jìn)行注入改性,在改性材料表面形成微圖形結(jié)構(gòu),使材料表面微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,但并不影響基體材料本身的性質(zhì),對(duì)于硅橡膠的表面改性具有較好的可行性。于是,在本研究中,我們采用了人體的組成性元素碳(C)對(duì)硅橡膠表面進(jìn)行注入處理,得到碳-硅橡膠(Carbonionimplantedsiliconerubber

4、,C-SR)。對(duì)改性后的材料采用掃描電鏡(Scanningelectronmicroscope,SEM)、原子力顯微鏡(AtomicForceMicroscope,AFM)、傅立葉紅外光譜(Fouriertransforminfraredspectrometer,FTIR)觀察材料表面的微觀形貌情況;通過(guò)X射線光電子能譜(X-rayphotoelectronspectroscopy,XPS)、X射線衍射(X-raydiffraction

5、,XRD)等技術(shù)檢測(cè)分析了改性材料表面的物理化學(xué)性能狀態(tài);同時(shí)采取了一系列試驗(yàn)對(duì)改性材料的細(xì)胞相容性進(jìn)行了分析和評(píng)價(jià)。以期能制備出一種符合臨床需要,且副反應(yīng)較少的新型軟組織填充材料。
　　研究方法：
　　本研究分為四部分:
　　第一部分:SR和碳-硅橡膠(C-SR)材料的制備及微觀形貌觀察
　　1.選用室溫硫化雙組份醫(yī)用液態(tài)硅橡膠制備普通硅橡膠,室溫固化完全后選擇表面平整光滑、無(wú)缺損、無(wú)明顯雜質(zhì)的材料,選擇三種離

6、子注入劑量(1015ions/cm2,3×1015ions/cm2,1016ions/cm2)對(duì)SR材料表面進(jìn)行離子注入,分別得到三種碳-硅橡膠改性材料(C-SR1、C-SR2及C-SR3)。
　　2.通過(guò)掃描電鏡(Scanningelectronmicroscope,SEM)、原子力顯微鏡(AtomicForceMicroscope,AFM)對(duì)改性材料表面的微觀形貌進(jìn)行觀察比較。
　　第二部分:SR及C-SR的表面理化性能

7、檢測(cè)
　　采用傅立葉紅外光譜(Fouriertransforminfraredspectrometer,FTIR)、X射線光電子能譜(X-rayphotoelectronspectroscopy,XPS)、X射線衍射(X-raydiffraction,XRD)等技術(shù)及水接觸角分析檢測(cè)并評(píng)價(jià)純SR、C-SR1、C-SR2及C-SR3材料表面的理化性能,并采用SPSS20.0進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　第三部分:材料的細(xì)胞相容性

8、評(píng)價(jià)
　　1.細(xì)胞準(zhǔn)備:應(yīng)用體外培養(yǎng)法培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞,并將細(xì)胞接種于各材料表面培養(yǎng),進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組情況為:
　　1)空白組:普通空白培養(yǎng)板中培養(yǎng)生長(zhǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞;
　　2)SR組:SR材料表面培養(yǎng)生長(zhǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞;
　　3)C-SR1組:C-SR1材料表面培養(yǎng)生長(zhǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞;
　　4)C-SR2組:C-SR2材料表面培養(yǎng)生長(zhǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞;
　　5

9、)C-SR3組:C-SR3材料表面培養(yǎng)生長(zhǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞。
　　3.通過(guò)激光共聚焦觀察各組改性材料表面細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架蛋白(actin)熒光表達(dá)情況,并采用CCK-8法檢測(cè)人真皮成纖維細(xì)胞在各組材料表面的增殖情況,對(duì)各組改性材料進(jìn)行生物安全性評(píng)價(jià)。
　　4.分別運(yùn)用免疫熒光技術(shù)、Real-timePCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)分析材料表面培養(yǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞中細(xì)胞粘附相關(guān)蛋白OPN、Vinculin、Zyin及T

10、alin的表達(dá)情況,對(duì)各組改性材料進(jìn)行生物功能性評(píng)價(jià)。
　　第四部分:材料細(xì)胞相容性提高的機(jī)制研究
　　1.采用免疫熒光染色檢測(cè)了在加入外源性O(shè)PN單克隆抗體或外源性重組OPN蛋白情況下,細(xì)胞骨架蛋白(actin)的表達(dá)情況,同時(shí)比較了各組材料表面細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì)胞粘附的差異。
　　2.采用WesternBlot技術(shù)檢測(cè)了材料表面細(xì)胞外培養(yǎng)上清中有無(wú)OPN的表達(dá)及其表達(dá)有無(wú)差異。
　　3.采用Trans-well

11、趨化試驗(yàn)檢測(cè)了OPN與MMP9是否能促進(jìn)細(xì)胞遷移,并通過(guò)明膠酶譜法檢測(cè)了各組材料表面細(xì)胞內(nèi)的MMP9活性高低情況。
　　4.在成功構(gòu)建了MMP9-RNAi模型的基礎(chǔ)上,通過(guò)加入與未加入外源性重組OPN,采用激光共聚焦顯微鏡觀察比較OPN與MMP9的表達(dá)變化,并觀察細(xì)胞的形態(tài)、增殖及粘附變化。
　　研究結(jié)果：
　　1.成功制備了SR,并采用多功能離子注入機(jī)在預(yù)先設(shè)定的條件下成功制備了三種不同離子注入條件的C-SR改性材料

12、。
　　2.使用SEM觀察C-SR改性材料與SR比較,微觀形貌無(wú)明顯差異。進(jìn)一步用AFM觀察得到,SR表面呈光滑樣,稍有不平;碳離子注入后,C-SR材料表面呈現(xiàn)丘陵樣地形,“突起”分布隨離子注入劑量的增加而增多,但分布較為均勻。
　　3.FTIR結(jié)果顯示,C-SR各組改性材料與SR比較無(wú)明顯變化,提示C-SR并未改變SR的有機(jī)官能團(tuán)構(gòu)成;C-SR的XRD圖譜較SR有所改變,形成了新的峰,提示C離子的注入在SR表面形成了新的晶

13、體結(jié)構(gòu),但差異并不顯著;XPS分析顯示經(jīng)過(guò)了碳離子注入的C-SR其Si、C、O三種原子的峰均發(fā)生了變化,其中C原子的百分比隨離子注入劑量的增高峰值越高,Si原子的百分比隨離子注入劑量的增高峰值越低,說(shuō)明碳離子注入后取代了部分Si原子,改變了材料的表面化學(xué)成分;通過(guò)水接觸角分析得到,C-SR的水接觸角較SR明顯降低,說(shuō)明碳離子注入可以改善SR材料表面的疏水性。
　　4.采用激光共聚焦顯微鏡觀察各組材料表面培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白(act

14、in)的表達(dá)情況得出,C-SR表面培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)actin的熒光表達(dá)量明顯較SR強(qiáng)烈,且隨著改性材料C離子注入劑量的增多,其表達(dá)量越高。
　　5.CCK-8法檢測(cè)材料表面細(xì)胞的增殖情況,結(jié)果顯示,C-SR表面培養(yǎng)的細(xì)胞較SR具有更好的細(xì)胞增殖能力,且隨著離子注入劑量的增加,其細(xì)胞增殖情況越好。
　　6.對(duì)各組材料表面培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞粘附相關(guān)蛋白(OPN、Vinculin、Talin、Zyxin)等進(jìn)行免疫熒光染色及Wester

15、nBlot檢測(cè)結(jié)果顯示,C-SR材料表面細(xì)胞表達(dá)的粘附相關(guān)蛋白(OPN、Vinculin、Talin、Zyxin)均優(yōu)于SR,并隨著碳離子注入劑量的增加,蛋白表達(dá)量越高。
　　7.Real-timePCR檢測(cè)結(jié)果顯示:與SR組相比,C-SR1組、C-SR2組和C-SR3組的細(xì)胞中Vinculin-mRNA、OPN-mRNA表達(dá)明顯增高(P<0.05),且在C-SR三組中比較,隨著離子注入劑量的增加,VinculinmRNA、OPN

16、mRNA表達(dá)呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。
　　8.在對(duì)OPN的作用研究中,我們加入外源性O(shè)PN單克隆抗體后,可觀察各組材料細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白的表達(dá)水平均有所下降,且細(xì)胞的形態(tài)、粘附情況也受到影響,而在加入外源性重組OPN蛋白后可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。
　　9.采用WesternBlot檢測(cè)到各組材料表面細(xì)胞外均有OPN的分泌,OPN可能在細(xì)胞外起橋梁蛋白作用,能夠調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白酶的表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞的粘附、增殖與遷移。
　　10.采用Trans-

17、well趨化試驗(yàn)檢測(cè)了OPN與MMP9的遷移能力,觀察到OPN與MMP9均具有促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用;進(jìn)一步在明膠酶譜試驗(yàn)中得到在C-SR材料上MMP9活性明顯高于SR。
　　11.成功構(gòu)建了MMP9-RNAi模型,并在此基礎(chǔ)上比較了加入與未加入外源性重組OPN蛋白情況下,觀察到未加入外源性重組OPN蛋白時(shí),MMP9與OPN的表達(dá)水平均有所下降,細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)狀態(tài)、增殖情況也較差,在加入了外源性重組OPN后,上述情況明顯有所改善。表

18、明,外源性O(shè)PN能上調(diào)MMP9表達(dá),兩者共同參與了改性材料細(xì)胞相容性的提高。
　　結(jié)論:
　　1.C-SR改性材料制作方法較為簡(jiǎn)便,具有可加工性,可行性較好。
　　2.C-SR改性材料表面理化性能穩(wěn)定,既保持了SR的優(yōu)良特性,又改善了SR的疏水性能,使其具有更好的組織親和力。
　　3.C-SR改性材料表面培養(yǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、增殖能力、細(xì)胞粘附能力均優(yōu)于SR,說(shuō)明C-SR較SR具有更好的細(xì)胞相容性,更適