膽汁中P16、APC基因甲基化狀態(tài)對惡性梗阻性黃疸的診斷意義.pdf

1、梗阻性黃疸( Obstructive jaundice)是膽管癌、胰頭癌等膽胰惡性腫瘤最主要的臨床表現(xiàn)。近年來隨著電子計算機斷層掃描(computerized tomography，CT)、核磁共振膽胰管成像(Magnetic resonance cholangiopancreatography，MRCP)、內(nèi)窺鏡逆行膽胰管造影(Endoscopic retrograde cholangiopancreatography，ERCP)、超

2、聲內(nèi)鏡(Endoscopic ultrasonography，EUS)等醫(yī)學(xué)影像技術(shù)的廣泛應(yīng)用，惡性梗阻性黃疸的定位診斷準(zhǔn)確性己取得長足的進步。但是，由于膽管癌、胰頭癌腫瘤病灶通常較小，尤其是在疾病早期，術(shù)前定性診斷仍較為困難。定性診斷的不確定性一方面會增加治療方案選擇的難度；另一方面也會為醫(yī)療糾紛埋下隱患。因此積極尋找靈敏性高、特異性好的惡性梗阻性黃疸的定性診斷方法具有十分重要的臨床意義。
　　 表觀遺傳學(xué)( epigenet

3、ics)是近年來興起的遺傳學(xué)的一門前沿分支學(xué)科。表觀遺傳學(xué)與經(jīng)典的遺傳學(xué)理論相對，是指在基因DNA序列沒有發(fā)生改變的情況下，基因的功能發(fā)生了可穩(wěn)定遺傳的變化，并最終導(dǎo)致了表型的變化。其包括：DNA甲基化修飾、組蛋白的各種修飾、染色質(zhì)重塑、非編碼RNA、X染色體失活等。越來越多的研究表明表觀遺傳學(xué)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。
　　 DNA甲基化(DNA methylation)是目前研究得最多的表觀遺傳學(xué)內(nèi)容，它是指由S-腺

4、苷甲硫氨酸提供一個甲基結(jié)合到CpG二核苷酸中的胞嘧啶變成5-甲基胞嘧啶(5-mc)。DNA甲基化大多發(fā)生在CpG較密集的CpG島。DNA甲基化時，染色體高度濃縮，染色體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)，導(dǎo)致抑癌基因和DNA損傷修復(fù)基因的失活，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前已有不少研究發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中存在抑癌基因甲基化。有研究者報道通過檢測外周血、尿液、糞便和痰液中某些基因的甲基化狀態(tài)可達到早期診斷腫瘤的作用。
　　 P16、APC基因是兩個重要的抑癌

5、基因，目前已有研究表明在膽管癌、胰腺癌、十二指腸癌中這兩個基因啟動子區(qū)域存在過度甲基化。本研究擬通過收集惡性梗阻性黃疸患者的新鮮膽汁，提取DNA，利用甲基化特異性PCR，檢測P16、APC基因啟動子區(qū)域的甲基化，結(jié)合臨床資料分析P16、APC基因甲基化在梗阻性黃疸良惡性鑒別中的價值。
　　 一、方法
　　 收集我院自2008年11月～2009年9月共10個月間以梗阻性黃疸為診斷的就診病例70例，其中病理學(xué)診斷為惡性48例

6、，良性22例。所有膽汁按TIANamp GenomicDNA kit說明書提取DNA，凝膠電泳法觀察膽汁DNA的質(zhì)量，紫外分光光度法檢測DNA的OD值、膽汁DNA的濃度。用Millipore公司的CpGenome DNAModification Kit S7820說明書步驟對DNA進行修飾后，甲基化特異性PCR進行擴增，在紫外燈下觀察產(chǎn)物條帶的位置及其強弱。
　　 二、結(jié)果
　　 1、通過利用TIANamp Genomi

7、c DNA kit能夠提取到純度較高的DNA，所有的膽汁OD值范圍為1.5～1.9之間，所有的膽汁DNA濃度約在50～200μg/ml之間。
　　 2、惡性腫瘤引起的梗阻病例中P16甲基化的占72.9％(35/48)。其中來自膽道系統(tǒng)的占69.4％(25/36)，來自胰腺的占87.5％(7/8)。良性疾病引起梗阻的病例中P16甲基化的占9％(2/22)，均為膽道系統(tǒng)結(jié)石。以病理學(xué)診斷為惡性作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，靈敏度72.9％，特異

8、性為90.9％。P16的甲基化陽性與年齡、性別、膽紅素、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，與腫瘤大小有密切相關(guān)( P=0.002)。
　　 3、惡性腫瘤引起的梗阻中APC基因甲基化的占56.25％(27/48)。其中來自膽道系統(tǒng)的占55.55％(20/36)，來自胰腺的占62.5％(5/8)，來自十二指腸乳頭占50％(2/4)。引起梗阻的良性疾病APC甲基化的占9％(2/22)，均為膽道系統(tǒng)結(jié)石。以病理學(xué)診斷為惡性作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，靈敏度56.2

9、％.特異性為90.9％。APC的甲基化陽性與年齡、性別、膽紅素、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，與腫瘤大小有密切相關(guān)( P<0.001)。
　　 三、結(jié)論
　　 膽汁中P16基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)能夠有效鑒別梗阻性黃疸的疾病性質(zhì)，具有靈敏度高，特異性好的優(yōu)點。膽汁中APC基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)鑒別梗阻性黃疸的疾病性質(zhì)特異性好，但靈敏度較差。P16和APC基因的聯(lián)合檢測啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)能夠有效鑒別梗阻性黃疸的疾病性質(zhì)，具有靈