高糖導(dǎo)致吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能障礙的機(jī)制研究.pdf

1、[背景]
　　 隨著生活水平的提高、生活方式的改變和人口的老齡化，糖尿病患病率在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)出上升趨勢，成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后的又一嚴(yán)重危害大眾健康的慢性非傳染性疾病。目前全球已診斷的糖尿病患者超過1.5億人，預(yù)測到2025年將增至3億人[1-2]。
　　 糖尿病合并嚴(yán)重感染是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一[3]。在應(yīng)用胰島素治療以前，感染是糖尿病的主要死因，直至二十世紀(jì)五十年代，糖尿病患者仍有較高的死亡率。近年來，隨

2、著胰島素和抗生素的應(yīng)用，糖尿病并發(fā)感染的死亡率有所下降，但仍占糖尿病死亡原因第二位。糖尿病患者的感染發(fā)生率高達(dá)36.8％，并仍有上升的趨勢[4]。因此，有效地防治感染對于降低糖尿病患者的死亡率非常重要。
　　 目前認(rèn)為糖尿病患者易并發(fā)各種感染，主要與高血糖狀態(tài)、機(jī)體防御機(jī)能減弱、糖尿病的并發(fā)癥、營養(yǎng)不良等因素有關(guān)，其中比較受關(guān)注的是機(jī)體防御機(jī)能減弱?？刂撇涣蓟虬橥Y酸中毒的糖尿病患者常同時(shí)有多種防御機(jī)能缺陷，對入侵微生物的的各反

3、應(yīng)階段都被抑制，從而極易感染，且程度嚴(yán)重。白細(xì)胞在抗感染方面發(fā)揮著重要作用。它參與機(jī)體非特異性免疫和特異性免疫過程，有吞噬、殺死病原體的作用，是機(jī)體抗感染的第一道防線。許多研究[5-8]對糖尿病患者白細(xì)胞吞噬殺菌功能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)血糖控制差的糖尿病患者，中性粒細(xì)胞的趨化、粘附、吞噬及氧化殺菌等功能均較正常人低，且與病情控制及代謝紊亂的程度有關(guān)。多數(shù)糖尿病患者白細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)亦有異常。近年來，對糖尿病患者白細(xì)胞吞噬殺菌功能降低機(jī)制的研究

4、越來越重視，國內(nèi)外很多學(xué)者分別從糖尿病患者白細(xì)胞膜脂流動性、胞內(nèi)堿性磷酸酶活力、溶酶體酶、調(diào)理素、Ca2+濃度、山梨醇及肌醇代謝狀態(tài)等方面進(jìn)行了研究[9-14]，但仍無定論。
　　 呼吸爆發(fā)是白細(xì)胞激活后行使殺菌功能的主要途徑。白細(xì)胞吞噬病原體后，主要通過呼吸爆發(fā)過程中，NADPH氧化酶(NOX)介導(dǎo)產(chǎn)生的大量活性氧(ROS)成分與其他細(xì)胞因子共同作用才能有效地殺死病原體。NOX是呼吸爆發(fā)的關(guān)鍵酶，呼吸爆發(fā)的過程實(shí)際上就是NOX

5、激活的過程。
　　 目前的研究發(fā)現(xiàn)，NOX蛋白家族是細(xì)胞產(chǎn)生ROS的重要酶類，主要包括NOX1、NOX2(gp91phox)、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2幾個(gè)亞型。白細(xì)胞中的NOX為NOX2，主要由2個(gè)膜蛋白亞單位(gp91phox和p22phox)，3個(gè)細(xì)胞質(zhì)亞單位(p47phox、p67phox和p40phox)，一個(gè)小分子量蛋白Rac以及最新發(fā)現(xiàn)的p29peroxiredoxin構(gòu)成[15]。p47

6、phox對于維持體內(nèi)中性粒細(xì)胞的正常殺菌功能是必須的[16,17]，它是NOX活化的起始點(diǎn)。當(dāng)中性粒細(xì)胞受到外界刺激被活化后，首先是胞質(zhì)中的p47phox被大量磷酸化，使得其構(gòu)象發(fā)生變化，分子間的緊密結(jié)合被打開，p67phox利用C端的SH3區(qū)域與p47phox磷酸化后所暴露出來的SH3和PX結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而磷酸化的p47phox則攜帶p67phox、p40phox向胞膜轉(zhuǎn)移，利用暴露的N端的SH3區(qū)域與p22phox伸出于細(xì)胞質(zhì)中的尾部

7、相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了胞膜亞單位與胞質(zhì)亞單位在胞膜上的集合與裝配，最后在胞膜上形成有活性的NOX，發(fā)揮其生物學(xué)作用[18-24]。因此p47phox磷酸化水平可直接反映NOX的活化程度。
　　 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)是細(xì)胞內(nèi)磷酸戊糖途徑(PPP)的關(guān)鍵酶。對G6PD的研究早在上世紀(jì)80年代就已進(jìn)入DNA水平，研究主要集中在G6PD缺乏癥基因突變方面[25]。近年來，美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Joslin糖尿病中心研究發(fā)現(xiàn)G6PD

8、與糖尿病腎病[26]、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能[27-29]等均存在密切聯(lián)系。目前認(rèn)為，G6PD不僅與糖尿病及其并發(fā)癥存在密切關(guān)系，還是白細(xì)胞正常發(fā)揮呼吸爆發(fā)功能的重要物質(zhì)。其活性直接關(guān)系到呼吸爆發(fā)的必需物質(zhì)NADPH的生成。
　　 除G6PD外，NOX在呼吸爆發(fā)中亦起至關(guān)重要的作用。由于在NOX蛋白家族中，NOX2主要存在于吞噬細(xì)胞，常被稱為吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶，是吞噬細(xì)胞抗菌系統(tǒng)的主要成分。吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)的啟動始于NOX2激活

9、。NOX活性與呼吸爆發(fā)功能的正常發(fā)揮密切相關(guān)。在呼吸爆發(fā)原料NADPH供應(yīng)充足時(shí)，如果NOX活化受阻，吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)仍然不能正常啟動?？梢?，吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)的正常發(fā)揮既需要保證PPP通路為其提供充足的供氫體以滿足其一系列化學(xué)反應(yīng)的需求，還需要其關(guān)鍵酶的正常激活來啟動并催化呼吸爆發(fā)反應(yīng)。兩者缺一不可。
　　 我們的前期研究主要觀察了糖尿病外周血白細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能與G6PD活性之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，持續(xù)的高糖環(huán)境刺激可明顯降低白

10、細(xì)胞G6PD活性，影響NADPH的產(chǎn)量。白細(xì)胞內(nèi)NADPH含量與G6PD活性的改變一致，并直接影響細(xì)胞的ROS產(chǎn)生能力，妨礙呼吸爆發(fā)功能的發(fā)揮。高糖刺激下白細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能降低與G6PD活性減弱明顯相關(guān)。與健康成人相比，2型糖尿病患者外周血白細(xì)胞G6PD活性、NADPH含量及細(xì)胞內(nèi)ROS水平均明顯降低，提示高糖可能通過影響白細(xì)胞G6PD活性進(jìn)而影響呼吸爆發(fā)。2型糖尿病患者中，血糖控制不良的患者與血糖控制良好的患者相比，其G6PD酶活性、

11、NADPH含量及細(xì)胞內(nèi)ROS水平的下降幅度更大，白細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能障礙更明顯。那么，除G6PD活性降低導(dǎo)致呼吸爆發(fā)原料NADPH產(chǎn)生減少而影響糖尿病患者白細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能，是否還存在其他機(jī)制導(dǎo)致糖尿病患者白細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能障礙呢？對此，我們進(jìn)行了進(jìn)一步研究。
　　 本研究將采用含不同濃度葡萄糖培養(yǎng)液離體培養(yǎng)的人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞作為研究對象，觀察細(xì)胞周圍環(huán)境中葡萄糖濃度對其呼吸爆發(fā)功能的影響，并探討高糖介導(dǎo)的呼吸爆發(fā)功能改

12、變的可能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 研究分為以下三部分進(jìn)行:
　　 第一章高糖對THP-1細(xì)胞呼吸爆發(fā)障礙的影響
　　 [目的]
　　 通過檢測不同處理組的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)活性、NOX活性及ROS產(chǎn)量，探討高糖介導(dǎo)呼吸爆發(fā)障礙的可能途徑。
　　 [方法]
　　 1.以人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，分為3組:高糖組(33.3mmol/L葡萄糖)，空白對照組(11.1mmo

13、l/L葡萄糖)、G6PD抑制組(11.1mmol/L葡萄糖+100umol/LDHEA)，每組6例。
　　 2.培養(yǎng)48h后，給予10umol/LFMLP處置30min，用分光光度法檢測THP-1細(xì)胞內(nèi)G6PD活性及NOX活性，用熒光探針法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量。
　　 3.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間資料比較用單因素方差分析（one-wayANOVA）。檢

14、驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α定為0.05。
　　 [結(jié)果]
　　 1.與空白對照組相比，高糖組及G6PD抑制組的G6PD活性、NOX活性及ROS產(chǎn)量均明顯降低，均存在顯著差異(P＜0.01)。
　　 2.高糖組與G6PD抑制組相比，其G6PD活性下降幅度相似，無顯著差異(P＞0.05)，其NOX活性及ROS產(chǎn)量降低更顯著(P＜0.01)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.正常糖濃度培養(yǎng)下，給予G6PD抑制劑處理后，THP-

15、1細(xì)胞的ROS釋放量下降，NOX活性亦下降，呼吸爆發(fā)功能啟動受到阻礙，ROS生成減少，提示單純抑制G6PD活性可導(dǎo)致THP-1細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能障礙。
　　 2.高糖環(huán)境不僅抑制G6PD活性，來阻礙THP-1細(xì)胞呼吸爆發(fā)障礙，還直接抑制THP-1細(xì)胞的NOX活性，導(dǎo)致ROS產(chǎn)量減少，呼吸爆發(fā)功能受損。
　　 第二章cAMP-PKA信號通路在高糖介導(dǎo)的THP-1細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能障礙中的作用
　　 [目的]
　　

16、 利用PKA特異性抑制劑PKI和PKA激動劑Forskolin預(yù)處理不同濃度葡萄糖培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞。探討cAMP-PKA信號通路在高糖介導(dǎo)的THP-1細(xì)胞G6PD活性改變及呼吸爆發(fā)功能障礙中的作用。
　　 [方法]
　　 1.以人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，分為4組:高糖組(33.3mmol/LD-GLU)、空白對照組(11.1mmol/LD-GLU)、PKA抑制組（33.3mmol/LD-GLU+10um

17、ol/LPKI）、PKA激動組（11.1mmol/LD-GLU+20umol/LForskolin），每組6例。
　　 2.培養(yǎng)48h后，給予10umol/LFMLP處置30min，用分光光度法檢測THP-1細(xì)胞內(nèi)G6PD活性及NOX活性，用熒光探針法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量，用ELISA法檢測cAMP含量。
　　 3.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間資料比較用單

18、因素方差分析（one-wayANOVA）。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α定為0.05。
　　 [結(jié)果]
　　 1.與空白對照組相比，高糖組及PKA激動組的G6PD活性、NOX活性及ROS產(chǎn)量均明顯降低，均存在顯著差異(P＜0.01)，PKA抑制組的G6PD活性、NOX活性及ROS產(chǎn)量未見明顯改變(P＞0.05)。高糖組與PKA激動組相比，其G6PD活性、NOX活性及ROS產(chǎn)量無顯著差異(P＞0.05)。
　　 2.與空白對照組相比，

19、高糖組及PKA激動組的cAMP含量均明顯升高，存在顯著差異((P＜0.01)。PKA抑制組的cAMP含量與空白對照組相比，無明顯差異(P＞0.05)。高糖組與PKA激動組相比，其cAMP含量無顯著差異(P＞0.05)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.持續(xù)的高濃度葡萄糖干預(yù)可明顯降低激活狀態(tài)下THP-1細(xì)胞的G6PD活性、NOX活性及ROS產(chǎn)量。高糖環(huán)境可同時(shí)降低NOX活性及G6PD活性，導(dǎo)致其呼吸爆發(fā)功能障礙。
　　

20、 2.PKA抑制劑能提高持續(xù)高糖培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞G6PD活性、NOX活性及ROS產(chǎn)量，從而恢復(fù)高糖所致的THP-1細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能障礙。提示高糖介導(dǎo)的THP-1細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能障礙與PKA通路激活有關(guān)。
　　 第三章高糖通過cAMP-PKA信號通路抑制THP-1細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能的可能機(jī)制
　　 [目的]
　　 通過檢測不同處理組的G6PD、Raf-1、ERK、p47phox的磷酸化水平，探討cAMP-PKA信

21、號通路抑制高糖環(huán)境下的THP-1細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能的可能機(jī)制。
　　 [方法]
　　 1.以人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，分為4組:高糖組(33.3mmol/LD-GLU)、空白對照組(11.1mmol/LD-GLU)、PKA抑制組(33.3mmol/LD-GLU+10umol/LPKI)、PKA激動組（11.1mmol/LD-GLU+20umol/LForskolin），每組6例。
　　 2.培養(yǎng)48h后

22、，給予10umol/LFMLP處置30min，用Western-blot法檢測各組G6PD、Raf-1、ERK、JNK、p38MAPK及p47phox的表達(dá)及磷酸化水平。
　　 3.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間資料比較用單因素方差分析（one-wayANOVA）。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α定為0.05。
　　 [結(jié)果]
　　 1.與空白對照組相比，高糖組及PKA激

23、動組的G6PD磷酸化表達(dá)增加，均存在顯著差異(P＜0.01);PKA抑制組的G6PD磷酸化表達(dá)未見明顯改變(P＞0.05)。
　　 2.與空白對照組相比，高糖組及PKA激動組的Raf-1磷酸化表達(dá)增加，ERKJNK及p38MAPK的磷酸化表達(dá)均減少，均存在顯著差異(P＜0.01);PKA抑制組的Raf-1、ERK、JNK及p38MAPK的磷酸化表達(dá)未見明顯改變(P＞0.05)。
　　 3.與空白對照組相比，高糖組及PKA

24、激動組的p47phox磷酸化表達(dá)減少，均存在顯著差異(P＜0.01);PKA抑制組的p47phox磷酸化表達(dá)未見明顯改變(P＞0.05)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.持續(xù)的高濃度葡萄糖干預(yù)可明顯增加激活狀態(tài)下THP-1細(xì)胞的Raf-1磷酸化表達(dá)，同時(shí)降低ERK、JNK、p38MAPK的磷酸化表達(dá)水平，從而使p47phox磷酸化表達(dá)減少，PKA激動劑同樣可使正常糖濃度培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞發(fā)生相同的磷酸化水平改變。提示cAM

25、P-PKA信號通路通過阻斷了MAPK通路中包括Ras/Raf/MEK/ERK、JNK及p38MAPK在內(nèi)的多條支路，來實(shí)現(xiàn)對p47phox活化的抑制，導(dǎo)致呼吸爆發(fā)功能障礙。
　　 2.持續(xù)的高濃度葡萄糖干預(yù)還可直接增加G6PD磷酸化，且同時(shí)伴隨p47phox磷酸化水平下降，提示高糖還可直接通過增加G6PD磷酸化來抑制G6PD活性，從而減少NADPH生成來抑制呼吸爆發(fā)功能。
　　 3.PKA抑制劑能減少Raf-1磷酸化水平