白藜蘆醇數(shù)據(jù)庫建立、深圳居民攝入量評(píng)估及生物效應(yīng)、代謝學(xué)研究.pdf

1、本研究結(jié)合我國居民食物消費(fèi)習(xí)慣，采集了華南，華北，華西及華中四個(gè)地區(qū)的數(shù)百種植物性食物，系統(tǒng)分析了白藜蘆醇及其衍生物在我國居民日常消費(fèi)的食物中的含量，旨在建立我國首個(gè)涉及面廣，植物性食物種類較為齊全的白藜蘆醇含量數(shù)據(jù)庫，并據(jù)此初步評(píng)估我國深圳市居民從日常白藜蘆醇攝入量，為進(jìn)行我國居民白藜蘆醇及其衍生物攝入水平和健康效應(yīng)關(guān)系研究提供科學(xué)資料，也為制訂我國居民主要植物化學(xué)物推薦攝入量和安全劑量等建議性標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，初步探討白藜蘆醇在體

2、內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)，并結(jié)合細(xì)胞和動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，探討白藜蘆醇的健康效應(yīng)和在防治代謝性疾病方面的作用及其相關(guān)機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下：
　　 第一部分、白藜蘆醇含量數(shù)據(jù)庫建立及深圳市居民攝入量初步評(píng)估
　　 目的：建立一套較為完整的食物中白藜蘆醇及其衍生物含量采集、處理、提取及分析方法，分析我國各地區(qū)常見食物樣品中白藜蘆醇及其衍生物的含量與分布，為我國建立白藜蘆醇及其衍生物含量的首個(gè)全面而系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫，并據(jù)此初步評(píng)估深圳居民從日

3、常食物中攝入的白藜蘆醇含量，為白藜蘆醇的功效學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：采集我國華南、華北、華西及華中四個(gè)代表性地區(qū)居民日常食用的蔬菜水果，進(jìn)行切塊處理，冷凍干燥后，對(duì)比超聲及浸提兩種方法的萃取效率，摸索前處理?xiàng)l件及分析方法。最后選用最佳萃取條件，以Hypersil ODS-C18(4.6mmx250mm，5μm)為色譜分析柱，柱溫35℃，雙流動(dòng)相為A(甲醇:乙酸:水=10:2:88)，B(甲醇:乙酸:水=90:2:8)，流速

4、1.0mL/min；進(jìn)樣量為20μL，雙熒光檢測器波長分別為330nm與374nm。在該色譜條件下分析樣品中的白藜蘆醇及其衍生物含量。利用統(tǒng)一的食物頻率調(diào)查問卷，調(diào)查深圳市15歲及以上居民日常各種食物消費(fèi)情況及消費(fèi)量，初步評(píng)估深圳市居民從日常食物中獲得的白藜蘆醇及白藜蘆醇苷攝入量。
　　 結(jié)果：樣品切塊處理較粉末狀獲得的白藜蘆醇總量高，超聲較浸提萃取效率高，且超聲40min，樣品-溶劑比為1:8 時(shí)，萃取條件最佳。結(jié)合最佳萃取條

5、件及HPLC分析發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)的同一種食物中白藜蘆醇及白藜蘆醇苷含量不同，同一地區(qū)的同一類蔬菜和水果中白藜蘆醇及白藜蘆醇苷含量也有差異，但其含量沒有明顯的地區(qū)及種類特異性。白藜蘆醇苷是蔬菜水果中的主要存在形式，且其含量多高于白藜蘆醇。同時(shí)，各地區(qū)相對(duì)獨(dú)特的蔬菜水果也是居民白藜蘆醇及其衍生物的主要攝入來源。含量最高者為華中地區(qū)水果中的紅提皮，白藜蘆醇總量超過了40μg/g。蔬菜中白藜蘆醇總量最高者當(dāng)屬華西地區(qū)的芹菜，達(dá)到7.86μg/g。

6、通過人群膳食調(diào)查發(fā)現(xiàn)，深圳市居民人均日常攝入的蔬菜約為332.1g，新鮮水果攝入相對(duì)少些，約為159.4g，谷類以大米為主，達(dá)到236.6g。根據(jù)本研究建立的白藜蘆醇含量數(shù)據(jù)，我們初步估算深圳市居民每天從植物性食物中攝入的白藜蘆醇總量約196.99μg，以一個(gè)60kg的成年人估算，約為3.28μg/kg.d。
　　 結(jié)論：本研究建立了系統(tǒng)而相對(duì)完整的植物性食物收集，前處理，分離提取及檢測分析白藜蘆醇及其衍生物含量的一整套方法。對(duì)

7、國內(nèi)四個(gè)代表性區(qū)域（華南，華北，華西，華中）的數(shù)百種植物性食物中反式-白藜蘆醇及反式-白藜蘆醇苷進(jìn)行了萃取分析，首次在我國建立了涉及面廣、食物種類較齊全的植物性食物白藜蘆醇含量數(shù)據(jù)庫。作為植物性食物為主的中國，蔬菜瓜果中白藜蘆醇總量雖然較低，卻是居民攝入白藜蘆醇及白藜蘆醇苷的主要食物來源。根據(jù)本研究對(duì)深圳市居民每日從植物性食物中攝入的白藜蘆醇總量進(jìn)行的初步評(píng)估結(jié)果，首次發(fā)現(xiàn)居民從日常植物性食物中攝入的白藜蘆醇總量相對(duì)較低，處于白藜蘆醇動(dòng)

8、物功效學(xué)研究中的較低劑量范圍，但是否達(dá)到了人群生物學(xué)效應(yīng)的有效劑量尚待研究。因此，本研究有利于進(jìn)一步研究居民膳食狀況對(duì)地區(qū)特異性疾病的影響及二者的流行病學(xué)關(guān)聯(lián)，對(duì)指導(dǎo)居民合理膳食、通過膳食營養(yǎng)途徑促進(jìn)健康和防治慢性疾病具有重要的意義。
　　 第二部分、白藜蘆醇改善牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性
　　 目的：通過高糖刺激牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)用白藜蘆醇加以干預(yù)，探討白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞高通透性的改善作用及可能的分子

9、機(jī)制。
　　 方法：33mmol/L 高糖與不同濃度的白藜蘆醇(0.1，1.0μmol/L)一起孵育牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，在培養(yǎng)單層細(xì)胞中用FITC-dextran (2.5μmol/L)觀察漏過熒光量的變化，通過NO 檢測試劑盒分析上清中NO分泌量，用PCR和Western blotting 技術(shù)分析eNOS 及Cav-1基因、蛋白及其磷酸化表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：白藜蘆醇可顯著降低高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞高通透性，刺激eNOS

10、 磷酸化蛋白表達(dá)及NO 產(chǎn)生(p<0.05)。白藜蘆醇對(duì)高糖處理后的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Cav-1基因及蛋白表達(dá)水平均具有下調(diào)作用(p<0.05)。用窖蛋白的抑制劑beta-環(huán)糊精(β-CD)預(yù)處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞通透性較高糖對(duì)照組顯著性降低，且一氧化氮合酶蛋白及磷酸化表達(dá)水平均升高。而一氧化氮合酶抑制劑L-NAME 則能促進(jìn)內(nèi)皮高通透性的發(fā)生，與白藜蘆醇作用相反。
　　 結(jié)論：白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞高通透性具有保護(hù)作用

11、，其分子機(jī)制可能與白藜蘆醇調(diào)節(jié)Cav-1/eNOS表達(dá)變化及NO 水平有關(guān)，其中Cav-1在該過程中發(fā)揮了非常重要的作用，為白藜蘆醇防治糖尿病等血管性疾病發(fā)現(xiàn)了一個(gè)重要靶點(diǎn)。
　　 第三部分、白藜蘆醇對(duì)高糖高脂飲食大鼠的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制探討
　　 目的：建立高糖高脂動(dòng)物模型，觀察白藜蘆醇對(duì)高糖高脂飲食大鼠體重，血糖血脂等的保護(hù)作用，研究白藜蘆醇對(duì)高糖高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠組織通透性及胰島素敏感性的影響，并深入探討白藜蘆醇

12、改善大鼠心血管系統(tǒng)組織通透性的相關(guān)分子機(jī)制。
　　 方法：六周齡雄性Wistar 大鼠45只，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按初始血糖和體重隨機(jī)分為5組，分別為對(duì)照組（正常組，高糖高脂組），白藜蘆醇干預(yù)組（50、100、150mg/kg·bw 三個(gè)不同劑量），每組9只，喂養(yǎng)13W。每天灌飼白藜蘆醇，每周監(jiān)測大鼠體重，每月監(jiān)測大鼠血糖、血脂水平變化。12W 末，進(jìn)行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)，胰島素耐量實(shí)驗(yàn)。13W 末，伊文思藍(lán)染色法檢測動(dòng)物組織通透性，

13、測定大鼠血糖、血脂及血胰島素，分別通過PCR和Western blotting 技術(shù)分析各組大鼠eNOS和Cav-1基因和蛋白表達(dá)水平的變化。
　　 結(jié)果：①白藜蘆醇灌飼4W，中、高劑量組大鼠體重顯著降低(p<0.05)。②白藜蘆醇對(duì)高糖高脂飲食誘導(dǎo)的主動(dòng)脈、心臟、肝臟和腎臟組織通透性損傷均具有不同程度的保護(hù)作用。③白藜蘆醇還可顯著降低大鼠血胰島素水平和HOMA-IR 指數(shù)，改善高糖高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠葡萄糖耐量和胰島素耐量異常（

14、p<0.05）。
　　 結(jié)論：白藜蘆醇可降低高糖高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠體重、血糖血脂水平。本研究進(jìn)一步在動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有改善血管組織內(nèi)皮通透性作用，且驗(yàn)證了白藜蘆醇的內(nèi)皮保護(hù)作用與機(jī)體內(nèi)Cav-1/eNOS分子表達(dá)的變化有關(guān)。同時(shí)，白藜蘆醇還顯著提高高糖高脂飲食大鼠胰島素敏感性，預(yù)防胰島素抵抗的發(fā)生，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
　　 第四部分、白藜蘆醇體內(nèi)代謝學(xué)研究
　　 目的：植物化學(xué)物的生物利用度和其在

15、體內(nèi)代謝途徑，代謝物的組織分布、轉(zhuǎn)化及排泄等方面的研究是確定植物化學(xué)物生物效應(yīng)的很重要的基礎(chǔ)。本研究旨在調(diào)查白藜蘆醇在體內(nèi)的生物利用度及其組織分布，為深入探討其健康生物學(xué)效應(yīng)和制訂人體推薦攝入量奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：六周齡Wister 大鼠10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，分裝于10個(gè)代謝籠中。實(shí)驗(yàn)前禁食10h，按體重灌胃給予大鼠50mg/kg 白藜蘆醇。選取HypersilODS-C18(4.6mmx250mm，5μm)色譜柱，柱溫

16、35℃，雙流動(dòng)相為A(甲醇:乙酸:水=10:2:88)，B(甲醇:乙酸:水=90:2:8)，流速1.0mL/min；進(jìn)樣量為20μL，雙熒光檢測器波長分別為330nm與374nm 高效液相色譜條件下分析大鼠血漿、尿液及各組織中反式-白藜蘆醇及其糖基化物的含量。并進(jìn)一步通過氣質(zhì)聯(lián)用儀分析不同時(shí)間血漿中代謝產(chǎn)物的種類。
　　 結(jié)果：白藜蘆醇灌飼1h后血漿中反式-白藜蘆醇濃度達(dá)到最大值，約4.79μg/mL，而其糖基化物反式-白藜蘆醇

17、苷則到3h后才達(dá)到峰值，且其濃度達(dá)到反式-白藜蘆醇原型含量的5倍，約23.78μg/mL。反式-白藜蘆醇及其糖基化衍生物可在白藜蘆醇攝入后24h 內(nèi)經(jīng)尿液大量排泄到體外，排泄率超過攝入量的一半，其中原型占90％以上，余下者在體內(nèi)各器官組織均有少量蓄積。
　　 結(jié)論：白藜蘆醇進(jìn)入大鼠體內(nèi)后在血漿中主要以糖基化衍生物形式存在。動(dòng)物體攝入白藜蘆醇24h后，有超過一半攝入量的白藜蘆醇可通過腎臟由尿液排出體外，其中白藜蘆醇原型達(dá)到90％以