臍帶血多能干細胞對帕金森氏病的治療潛能.pdf

1、研究背景
　　 帕金森氏病是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，該病主要病理改變是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元脫失。多巴胺能神經(jīng)元在控制人體隨意運動和調(diào)節(jié)姿勢位置中起著關(guān)鍵作用。迄今為止，藥物對帕金森氏病的治療還極為有限，只能在一定程度上改善癥狀，不能阻止疾病的進展。因此仍需研究尋找一種新的治療方法，能夠長期有效地控制癥狀，甚至從根本上治愈帕金森氏病。干細胞是一類有自身再生能力的細胞，可以分化成不同來源的組織，補充損傷及老化的組織細胞，這為治療

2、帕金森氏病提供了可能的途徑。人臍血來源干細胞與其他種類的干細胞相比具有特殊的優(yōu)勢:(1)來源充足(2)不牽涉?zhèn)惱韱栴}(3)對捐贈者無明顯損傷(4)不容易產(chǎn)生移植物抗宿主反應。其中一類新的臍血干細胞種類被稱為臍血多能干細胞。這類細胞具有胚胎細胞的特性，有多向分化潛能。臍血多能干細胞在神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的研究領(lǐng)域已有一定的相關(guān)研究，已經(jīng)證明，通過使用神經(jīng)生長因子可以誘導其分化為神經(jīng)元細胞。而全反式維甲酸是已經(jīng)證明的可以誘導神經(jīng)細胞形成，軸突生

3、長和促進多巴胺能神經(jīng)元分化的有效誘導劑。本研究通過采用全反式維甲酸誘導臍血多能干細胞向多巴胺能神經(jīng)元分化，探索臍血多能干細胞在治療帕金森氏病中的作用。
　　 研究方法
　　 1.臍血多能干細胞的制備
　　 在捐贈者的新鮮臍帶中收集臍帶血，加入淋巴細胞分離液分離單個核細胞，加入紅細胞分離液分離出紅細胞。分離出單個核細胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　 2.細胞分化
　　 臍血多能干細胞在生長至70％匯合時

4、在神經(jīng)細胞培養(yǎng)基內(nèi)分別加入5μmol/L及10mol/L全反式維甲酸進行培養(yǎng)，并設(shè)陰性及陽性對照。誘導12天后檢測細胞特異性標記物和多巴胺。
　　 3.實時定量PCR
　　 采用實時定量PCR技術(shù)檢測多巴胺神經(jīng)元特異性標記物的mRNA在細胞內(nèi)的表達水平。使用Qiagenkit(Valencia，CA)提取細胞總RNA。根據(jù)QuantiTectReverseTranscriptionkit(Qiangen，Valencia

5、，CA)說明書將總RNA合成為單鏈cDNA。以ABIPrism7900HTFastReal-TimePCR系統(tǒng)(AppliedBiosystems，CA)對每例樣本進行實時定量PCR檢測。基因特異性PCR引物由SABiosciences(Frederick，MD)公司設(shè)計并合成。結(jié)果以β-actin作為內(nèi)參。
　　 4.Westernblot分析
　　 為確定多巴胺能神經(jīng)細胞轉(zhuǎn)錄因子的表達情況，我們采用Westernbl

6、ot進行分析。細胞充分清洗后用預冷PBS洗滌，加入裂解液溶解蛋白，離心，蛋白樣本與上樣緩沖液混合，煮沸。上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜。分離后的蛋白用脫脂奶粉封閉，分別與Nurr1，En1和Wnt1Abs抗體孵育。以β-actin為內(nèi)參。
　　 5.免疫細胞化學
　　 全反式維甲酸處理的臍血多能干細胞及對照組細胞采用4％多聚甲醛固定，用0.5％TritonX100破膜，封閉，分別與抗酪氨酸羥化酶抗體，抗多巴胺轉(zhuǎn)運體抗體，抗神經(jīng)細胞核抗

7、體，抗角質(zhì)蛋白酸性纖維抗體，抗βⅢ微管蛋白抗體，抗微管結(jié)合蛋白2抗體等一抗孵育。充分清洗后與相應熒光素標記二抗孵育，采集圖像并進行分析。
　　 6.多巴胺酶聯(lián)免疫吸附試驗
　　 采用全反式維甲酸處理12天后檢測處理組與對照組多巴胺的釋放。細胞棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗，分別加入含5.33mmol/L及56mmol/L鉀離子的Hank's平衡鹽溶液。5分鐘后測定細胞上清液內(nèi)多巴胺的含量。
　　 研究結(jié)果
　　

8、 1.臍血多能干細胞有向多巴胺神經(jīng)細胞分化的潛能:
　　 臍血多能干細胞由多人的臍帶血制備而成。為評估臍血多能干細胞向多巴胺神經(jīng)元的分化，我們檢測了多巴胺特異神經(jīng)元Nurr1、Wnt1和En1等特異轉(zhuǎn)錄因子的表達。實時定量PCR結(jié)果顯示未處理組中臍血多能干細胞內(nèi)表達Nurr1，Wnt1，andEn1等mRNA。Westernblot分析進一步表明三種蛋白均有表達。實時定量PCR也表明臍血多能干細胞內(nèi)酪氨酸羥化酶mRNA表達水平較

9、低。而酪氨酸羥化酶是催化酪氨酸合成二羥多巴胺的關(guān)鍵酶。這些結(jié)果表明臍血多能干細胞有向多巴胺能神經(jīng)細胞分化的潛能。
　　 2.通過全反式維甲酸誘導可使臍血多能干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞:
　　 通過實驗我們評估了兩種濃度全反式維甲酸對臍血多能干細胞的影響。5μmol/L與10μmol/L這兩種濃度均可以誘導細胞發(fā)生形態(tài)學的改變，向神經(jīng)元分化。而全反式維甲酸的濃度越高，則向神經(jīng)元分化的細胞比例越大。大多數(shù)細胞(90％)在經(jīng)過1

10、0μmol/L全反式維甲酸處理5-8天后表現(xiàn)出典型的神經(jīng)元的形態(tài)，當處理后10-12天，這一變化更加明顯，細胞形成更長的分枝狀突起。當以5μmol/L全反式維甲酸處理10-12天后有35％細胞分化形成神經(jīng)元細胞樣形態(tài)，但形成軸突較短。在神經(jīng)元培養(yǎng)基對照組中大多數(shù)細胞(＞95％)沒有表現(xiàn)出向神經(jīng)元細胞的分化。而在無血清培養(yǎng)基內(nèi)，臍血多能干細胞經(jīng)過培養(yǎng)后仍然是圓形，無明顯形態(tài)改變。
　　 通過免疫染色顯示神經(jīng)細胞特異性標志物微管蛋白

11、βⅢ、微管結(jié)合蛋-2、成熟神經(jīng)元標志物抗原、膠質(zhì)細胞標志物角質(zhì)蛋白酸性纖維等。結(jié)果顯示全反式維甲酸誘導后90±4％細胞微管蛋白βⅢ、微管結(jié)合蛋-2表達明顯增強;70±7％細胞經(jīng)全反式維甲酸誘導后成熟神經(jīng)元標志物抗原表達陽性;只有少數(shù)細胞表達角質(zhì)蛋白酸性纖維(5±2％)。在神經(jīng)細胞培養(yǎng)基對照組中約有(5％)細胞表達微管蛋白βⅢ、微管結(jié)合蛋-2、成熟神經(jīng)元標志物抗原、膠質(zhì)細胞標志物角質(zhì)蛋白酸性纖維等。這些結(jié)果證明通過使用10μmol/L全反

12、式維甲酸誘導臍血多能干細胞可使其分化成為神經(jīng)元樣細胞。
　　 3.經(jīng)全反式維甲酸誘導后臍血多能干細胞分化成功能性多巴胺能神經(jīng)元，并刺激后可釋放多巴胺:
　　 我們通過免疫熒光的方法檢測多巴胺能神經(jīng)元特異性蛋白，包括酪氨酸羥化酶和多巴胺轉(zhuǎn)運體。結(jié)果顯示:經(jīng)全反式維甲酸處理后約48±11％的細胞表達酪氨酸羥化酶;36±9％的細胞表達多巴胺轉(zhuǎn)運體。而在神經(jīng)培養(yǎng)基血清對照組中僅有少量細胞(5±1％)表達酪氨酸羥化酶和多巴胺轉(zhuǎn)運體

13、。結(jié)果證明通過全反式維甲酸誘導可以使臍血多能干細胞分化成為多巴胺能神經(jīng)元。
　　 通過細胞外鉀離子刺激導致細胞去極化，檢測經(jīng)全反式維甲酸誘導后臍血多能干細胞是否會釋放多巴胺。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測結(jié)果顯示以10μmol/L全反式維甲酸處理組的細胞，經(jīng)鉀離子刺激后細胞外多巴胺水平顯著升高(P＜0.001)。結(jié)果證明采用10μmol/L全反式維甲酸處理后臍血多能干細胞可以誘導分化為有功能的釋放多巴胺的神經(jīng)元樣細胞。