microRNA-141及HMGB1shRNA構(gòu)建及干擾效果的驗(yàn)證.pdf_第1頁(yè)
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1、目的:構(gòu)建有效靶向小鼠HMGB1基因的microRNA-141及HMGB1 shRNA干擾載體。
　　方法:1.由miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)查找獲得microRNA-141成熟序列，設(shè)計(jì)目的基因片段并人工合成，將microRNA-141序列和載體pYr-miR-30-shRNA經(jīng)雙酶切后連接生成pYr-adv-mmu-miR141重組質(zhì)粒，用BglⅡ、XhoⅠ雙酶切后測(cè)序比對(duì);重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠肝癌細(xì)胞株Hepal-6，采用Q-PCR、W

2、estern blot驗(yàn)證干擾效果。2.針對(duì)小鼠HMGB1基因序列設(shè)計(jì)4條HMGB1 shRNA干擾序列:pYr-1.1-musHMGB1 sh1～4，XhoⅠ酶切后測(cè)序比對(duì);重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠肝癌細(xì)胞株Hepal-6，采用Q-PCR、Western blot驗(yàn)證干擾效果。
　　結(jié)果:1.經(jīng)酶切凝膠電泳證實(shí)microRNA-141序列構(gòu)建正確，轉(zhuǎn)染microRNA-141的小鼠肝癌細(xì)胞株Hepal-6中HMGB1表達(dá)量明顯低于陰性對(duì)

3、照組及未處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。2.經(jīng)酶切凝膠電泳證實(shí)pYr-1.1-musHMGB1 sh1～4序列構(gòu)建正確，但質(zhì)粒篩選實(shí)驗(yàn)表明pYr-1.1-musHMGB1 sh1～4干擾效果與對(duì)照組比較沒(méi)有明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:1.pYr-adv-mmu-miR141序列構(gòu)建正確，且能成功抑制hepal-6細(xì)胞株HMGB1基因的表達(dá)。2.pYr-1.1-musHMGB1 sh1～4序列構(gòu)建正確，但不能成功

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