ApoG2對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞放射增敏作用及與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用協(xié)同效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　 乳腺癌是目前威脅婦女生命健康常見的惡性腫瘤之一。我國(guó)是乳腺癌發(fā)病率增長(zhǎng)較快的國(guó)家之一，中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)公布的統(tǒng)計(jì)數(shù)字顯示，我國(guó)近年來(lái)乳癌發(fā)病率正以每年3％的速度增加，成為城市中死亡率增長(zhǎng)較快的腫瘤;除此之外，患者的發(fā)病年齡呈逐漸年輕化的趨勢(shì)。盡管治療上近幾年取得較大的進(jìn)展，但是仍然有較多的患者在治療中(后)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)。因此深入研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找更有效治療乳腺癌的方法是必要的。
　　 化療作為治療

2、乳腺癌的重要手段，但在治療的同時(shí)，其副作用也是不容忽視的。例如:骨髓抑制，消化道反應(yīng)，免疫功能降低，抗感染能力下降，皮膚、粘膜損害，神經(jīng)系統(tǒng)的損傷等，當(dāng)患者不能耐受時(shí)，將嚴(yán)重影響治療效果。對(duì)于放療，無(wú)論是術(shù)前放療或術(shù)后放療均可降低局部復(fù)發(fā)率和提高總生存率;在乳腺癌綜合治療過(guò)程中，放射治療已經(jīng)成為治療腫瘤的重要手段。但在臨床應(yīng)用中多種因素會(huì)影響放療的效果。包括腫瘤細(xì)胞本身的放射敏感性以及腫瘤對(duì)放射線的抵抗，而腫瘤周邊正常組織又限制了放射劑

3、量的增加，嚴(yán)重影響放療的療效。因此如何克服腫瘤的放射抗性，提高腫瘤的放射敏感性已成為人們關(guān)注和研究的課題。目前使用放射增敏劑來(lái)提高放療效果已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。放射增敏劑是指通過(guò)應(yīng)用化學(xué)或生物手段來(lái)增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性.但同時(shí)又不明顯增加對(duì)正常組織的毒性，一個(gè)理想的放射增敏劑，應(yīng)當(dāng)滿足以下六點(diǎn)要求:
　　 ①對(duì)正常組織細(xì)胞不增敏，但能對(duì)腫瘤細(xì)胞增敏;
　　 ②對(duì)正常組織無(wú)毒性或毒性很小;
　　 ③具有理想的脂

4、水分配系統(tǒng)，能透入腫瘤細(xì)胞或乏氧區(qū)，不分布或少量分布到易引起毒性反應(yīng)的正常組織部位;
　　 ④化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，生物半衰期適當(dāng);
　　 ⑤在整個(gè)細(xì)胞的周期中都有效;
　　 ⑥治療中，較低的藥物劑量即可起到放射增敏作用。
　　 紫杉醇是從紫衫(紅豆杉)樹皮中提取的一種抗癌藥，是紅豆杉屬植物中的一種復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，也是目前所了解的惟一一種可以促進(jìn)微管聚合和穩(wěn)定已聚合微管的藥物。同位素示蹤表明，紫杉醇只結(jié)合到

5、聚合的微管上，不與未聚合的微管蛋白二聚體反應(yīng)。接觸紫杉醇后，細(xì)胞內(nèi)會(huì)積累大量的微管，這些微管的聚集干擾了細(xì)胞功能，特別是使細(xì)胞分裂停止于有絲分裂期，阻斷了細(xì)胞的正常分裂。紫杉醇主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對(duì)肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也具有一定療效;但存在明顯劑量限制性毒性，給臨床應(yīng)用帶來(lái)一定的局限性。
　　 棉酚(gossypol)系存在于錦葵科棉屬植物棉花的種子、葉、莖及根部等器官中的一種含量較高的黃色多元酚

6、類化合物，是Bcl-2的小分子抑制劑。研究表明，棉酚的活性成分是左旋棉酚，其主要作用于Bcl-2/Bcl-xl基因，阻止其與促凋亡基因如Bak、Bax、Bad等結(jié)合形成異源二聚體，從而引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中，棉酚均表現(xiàn)出有效的抗腫瘤活性。Apogossypolone(ApoG2)是棉酚的一種新型衍生物，其毒性低，副作用小，腫瘤殺傷效果好。對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用較左旋棉酚強(qiáng)，顯示出更好的發(fā)展前景。本研究以人乳腺癌MCF

7、-7細(xì)胞系為對(duì)象，研究ApoG2與放療，化療聯(lián)合的協(xié)同效應(yīng)，并探討可能的作用機(jī)制，為乳腺癌治療提供一些新的研究方向。
　　 研究目的:
　　 本實(shí)驗(yàn)以高表達(dá)Bcl-2的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7為對(duì)象，研究ApoG2對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的放射增敏作用，及與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用的協(xié)同效應(yīng)，并初步探討其可能的作用機(jī)制，為ApoG2的進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，奠定理論基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.采用

8、 MTT體外增殖法研究ApoG2，單純照射組及兩者聯(lián)合作用72h對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的體外增殖抑制作用，并計(jì)算q值大小;
　　 2.MTT法檢測(cè)紫杉醇、ApoG2單藥及兩者聯(lián)合作用48h對(duì)MCF-7細(xì)胞的毒性，并計(jì)算CDI(兩藥相互作用指數(shù));
　　 3.采用平板克隆形成分析法計(jì)算各組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)SF，通過(guò)“多靶單擊數(shù)學(xué)模型”擬合細(xì)胞存活曲線，并觀察(2、4、6、8Gy)單純照射及(2.5、5μmol/L) ApoG

9、2+(2、4、6、8Gy)照射組對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用;
　　 4.放射敏感性實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組1:(對(duì)照組、5μmol/LApoG2組、8 Gy射線組、5μmol/LApoG2+8 Gy射線組)，化療敏感性實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組2:(對(duì)照組、10μmol/LApoG2組、0.25μmol/紫杉醇組、10μmol/LApoG2+0.25μmol/L紫杉醇組)。用Hoechst33258熒光染色法及AO熒光染色法觀察MCF-7細(xì)胞在上述分組處理作用

10、48h后引起的凋亡和自噬形態(tài)學(xué)的變化;
　　 5.流式細(xì)胞儀分析經(jīng)上述分組處理的MCF-7細(xì)胞的凋亡率及自噬熒光強(qiáng)度變化;
　　 6.Western blot法檢測(cè)經(jīng)上述分組處理的MCF-7細(xì)胞Bcl-2蛋白及Beclinl蛋白表達(dá)變化。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.通過(guò) MTT體外增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)提示ApoG2、射線對(duì)MCF-7細(xì)胞系分別作用72h后具有生長(zhǎng)增殖抑制作用(FApoG2＝197.338，P＝0

11、.000; F射線=647.817，P=0.000)，兩者聯(lián)合作用72h后，抑制率隨著藥物濃度及射線劑量的增加逐漸增強(qiáng)，兩者之間存在交互效應(yīng)(F=15.200，P=0.000)。通過(guò)計(jì)算q＞1.15，ApoG2與射線聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用。不同濃度ApoG2、紫杉醇對(duì) MCF-7細(xì)胞分別作用48h后具有生長(zhǎng)抑制作用(FApoG2=156.916，P=0.000;Fpaclitaxel=129.904，P=0.000)，兩者聯(lián)合作用48h后

12、，抑制率隨著兩者藥物濃度的增加逐漸增強(qiáng)，兩者之間存在交互效應(yīng)(F=12.402，P=0.000)。通過(guò)計(jì)算CDI＜1，ApoG2與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同效應(yīng)。
　　 2.平板克隆實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)射線(2，4，6，8Gy)、(2.5，5μmol/L) ApoG2+射線(2，4，6，8Gy)作用于乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞2周后，單純照射組、2.5μmol/L+照射組和5μmol/L+照射組的細(xì)胞存活率隨著射線劑量的增加逐漸降低，差異具有

13、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F單純照射=264.308，P單純照射=0.000;F2.5μmol/L+照射＝180.204，P2.5μmol/L+照射=0.000;F5μmol/L+照射＝214.737，P5 mol/L+照射=0.000)。通過(guò)單擊多靶模型擬合曲線顯示:單純照射組Do、Dq分別為1.925，3.564Gy，2.5μmol/L ApoG2+照射組Do、Dq、SER(Do值比)、SER(Dq值比)分別為1.688 Gy，2.123 Gy，

14、1.140，1.679，5μmol/LApoG2+照射組Do、Dq、SER(Do值比)、SER(Dq值比)分別為1.317Gy，1.675Gy，1.462，2.128。低濃度的ApoG2作用后Do、Dq均低于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組曲線低劑量區(qū)“肩區(qū)”明顯縮小變窄，且各劑量點(diǎn)的存活分?jǐn)?shù)均低于對(duì)照組，提示細(xì)胞亞致死性放射損傷修復(fù)能力降低。
　　 3.Hoechst33258熒光染色法可見5μmol/LApoG2、8 Gy射線及兩者聯(lián)合作用于

15、MCF-7細(xì)胞48h，10μmol/LApoG2、0.25μmol/紫杉醇及兩者聯(lián)合作用48h后，熒光顯微鏡下可見核固縮、碎裂，染色質(zhì)凝集、凋亡小體形成等凋亡現(xiàn)象;而對(duì)照組細(xì)胞則呈現(xiàn)彌散均勻，淡藍(lán)色的正常細(xì)胞核。ApoG2與紫杉醇聯(lián)合作用組較單獨(dú)處理組凋亡現(xiàn)象更明顯，而ApoG2與射線聯(lián)合組較單獨(dú)處理組比較凋亡現(xiàn)象未見明顯增加;AO(吖啶橙)熒光染色法可見對(duì)照組細(xì)胞胞漿或胞核染成亮綠色熒光，處理組胞漿或胞核可見亮紅色熒光，為酸性自噬泡，

16、聯(lián)合作用組較單獨(dú)處理組自噬現(xiàn)象更明顯。
　　 4.流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)可見5μmol/LApoG2，8Gy射線及兩者聯(lián)合作用于MCF-7細(xì)胞48h后，不同處理組凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.074，P=0.000);不同處理組自噬熒光強(qiáng)度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=470.809，p＝0.000)。聯(lián)合作用組細(xì)胞自噬熒光強(qiáng)度較單獨(dú)處理組升高(P＜0.05)，但聯(lián)合作用組凋亡率較單獨(dú)處理組并不都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。10μmol/LApo

17、G2，0.25μmol/L紫杉醇及兩者聯(lián)合作用于MCF-7細(xì)胞48h后，不同處理組凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=571.563，P＝0.000);不同處理組自噬熒光強(qiáng)度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=204.422，P=0.000)。聯(lián)合作用組細(xì)胞凋亡率和自噬熒光強(qiáng)度均較單獨(dú)處理組升高(P＜0.05)。
　　 5.Western blot檢測(cè)結(jié)果提示5μmol/LApoG2，8Gy射線及兩者聯(lián)合作用于MCF-7細(xì)胞48h后，不同處理組B

18、eclinl，Bc1-2蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FBeclinl=176.562，PBeclinl=0.000;FBcl-2=470.809，PBcl-2=0.000);兩者聯(lián)合作用組Beclinl蛋白表達(dá)較單獨(dú)處理組升高(P＜0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)較單獨(dú)處理組降低(P＜0.05)。10μmol/LApoG2，0.25μmol/L紫杉醇及兩者聯(lián)合作用于MCF-7細(xì)胞48h后，不同處理組Beclinl，Bcl-2蛋白表達(dá)差異具

19、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FBeclinl＝57.266，pBeclinl=0.000; FBcl-2=138.495，PBcl-2=0.000);兩者聯(lián)合作用組Beclinl蛋白表達(dá)較單獨(dú)處理組升高(P＜0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)較單獨(dú)處理組降低(P＜0.05)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　 ApoG2能夠增加人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7對(duì)放射的敏感性，還可以提高紫杉醇對(duì)MCF-7細(xì)胞殺傷效應(yīng)。其機(jī)制可能與ApoG2誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和自