LSD1抑制劑TCP體外對(duì)腎癌786-O細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的:
　　初步研究賴氨酸特異性脫甲基酶1( LSD1)抑制劑反苯環(huán)丙胺對(duì)腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響,并初步探討其機(jī)制。
　　方法:
　　1、細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn):細(xì)胞培養(yǎng)成功后行 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度梯度下的反苯環(huán)丙胺(TCP)干預(yù)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的786-O細(xì)胞24h、48h和72h后的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率,并設(shè)調(diào)零孔和對(duì)照組,計(jì)算50％致死濃度(IC50),然后繪制濃度-時(shí)間抑制率曲線圖;實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2、
　　2、采用流式細(xì)胞儀(Annexin V/PI雙染法)分析、計(jì)算細(xì)胞凋亡率,并繪制曲線圖。
　　3、Trizol法提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞總RNA,應(yīng)用分光光度計(jì)法檢測(cè)RNA濃度、純度,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性,使用半定量RT-PCR檢測(cè)LSD1基因mRNA的表達(dá)量變化。
　　4、Western-blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞LSD1蛋白表達(dá)量變化。
　　5、采用劃痕試驗(yàn)觀察TCP對(duì)786-O細(xì)胞遷移力的

3、影響,拍照觀察12h、24h和48h細(xì)胞遷移距離。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　6、Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度梯度的 TCP作用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的786-O細(xì)胞24h侵襲到Tanswell小室下室面的數(shù)目,同時(shí)設(shè)立對(duì)照組,予以0.1%的結(jié)晶紫染色后拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　7、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包的單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;以P<0.01

4、為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;以P>0.05為差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、不同濃度(0、10、20、40、80、160和320uM)的TCP作用于786-O細(xì)胞24h、48h和72h后,MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示,1‰的DMSO溶液對(duì)786-O細(xì)胞無(wú)影響,TCP對(duì)786-O細(xì)胞的增殖有抑制作用,10uM以上隨藥物濃度的增大、作用時(shí)間的延長(zhǎng),抑制作用隨之增強(qiáng),呈現(xiàn)明顯的時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.01)。計(jì)算出24h、48h和

5、72h TCP的IC50值分別為133.76uM、67.66uM和36.02uM。
　　2、流式細(xì)胞儀AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡分析表明, TCP作用腎癌786-O細(xì)胞48h,0uM組、DMSO組和10uM組兩兩比較,凋亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),40uM-160uM組隨濃度的增高,早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的比例都逐漸增加,與對(duì)照組相比差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。同時(shí),細(xì)胞壞死率也同

6、步增高,說(shuō)明TCP具有細(xì)胞毒性作用,隨藥物濃度增高,毒性隨之增大;
　　3、TCP處理786-O細(xì)胞48h后LSD1基因mRNA表達(dá)量的分析,40uM和80uM組的表達(dá)明顯低于0uM組及1‰DMSO組LSD1基因mRNA表達(dá)量(P<0.01);0uM組與1‰DMSO組比較,結(jié)果無(wú)明顯差異(P>0.05);
　　4、Western-blot分析TCP處理細(xì)胞48h后LSD1蛋白在786-O細(xì)胞中的表達(dá)情況,40uM和80uM組

7、的表達(dá)明顯低于0uM組及1‰DMSO組LSD1蛋白表達(dá)量(P<0.01);1‰DMSO組與0uM組比較,結(jié)果無(wú)明顯差異(P>0.05);
　　5、采用劃痕試驗(yàn)觀察TCP對(duì)786-O細(xì)胞遷移力的影響,結(jié)果顯示:0uM組24h及48h愈合率分別為35.14%±3.91%、59.46%±4.36%;1‰DMSO組24h及48 h愈合率分別為38.12%±3.86%、56.52%±4.68%;40uM組處理24 h后愈合率為28.64%±

8、3.15%、處理48 h愈合率為39.72%±4.11%;80uM組處理24 h愈合率為21.11%±4.18%、處理48 h愈合率為30.81%±3.74%。TCP處理786-O細(xì)胞后,細(xì)胞的遷移能力明顯低于0uM組和1‰DMSO組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。0uM組和1‰DMSO組比較,遷移力無(wú)明顯差異(P>0.05)。表明TCP處理后786-O細(xì)胞遷移能力明顯下降,且與時(shí)間和濃度呈正相關(guān),1‰DMSO對(duì)786-O細(xì)胞的遷移

9、力無(wú)影響;
　　6、應(yīng)用Transwell小室檢測(cè)TCP對(duì)腎癌786-O細(xì)胞侵襲能力的影響,TCP以40、80uM作用腎癌786-O細(xì)胞24h,對(duì)照組(0uM組、1‰DMSO組)亦作用24h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0uM組、1‰DMSO組兩兩比較,侵襲到平鋪基質(zhì)膠的Transwell小室下室面的細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異,分別為286.25±25.81和294.82±24.36,說(shuō)明1‰DMSO對(duì)768-O細(xì)胞的侵襲能力無(wú)明顯影響;40uM和80uM組侵

10、襲到小室下室面的細(xì)胞數(shù)分別為195.86±19.43和115.76±18.56,表明隨濃度的增高,穿過(guò)Transwell小室膜的細(xì)胞數(shù)逐漸減少,細(xì)胞的侵襲力逐漸下降(P<0.05)。與對(duì)照組相比差異具有顯著性(P<0.01)。說(shuō)明TCP對(duì)786-O細(xì)胞侵襲數(shù)目的抑制呈濃度依賴性。
　　結(jié)論:
　　1、LSDl抑制劑TCP在體外可以抑制腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞的增殖,且呈濃度-時(shí)間依賴性;
　　2、TCP可以誘導(dǎo)體外培