人CYP3A4兩個新非同義突變酵母表達系統(tǒng)的建立及其多態(tài)性在體外代謝和藥物篩選中研究.pdf

1、人細胞色素P450(CYP)超家族是一類混合功能單加氧酶，主要存在于肝微粒體中，參與內(nèi)源性化合物(如膽汁酸、甾體類激素、脂肪酸、前列腺素等)和外源性化合物(藥物、致癌物、毒物前致突變物)的生物轉(zhuǎn)化。按照CYP一級結(jié)構(gòu)同源性的差異，CYPs可分成多個家族。其中CYP3A家族約占CYPs總量的30％，與其他家族相比，CYP3A酶蛋白的含量在肝微粒體中占有較高的比例且存在多種形式(例如：CYP3A4，CPY3A7，CYP3A43等)。已知CY

2、P3A4占肝臟及腸道中CYPs總含量的50％以上，負責代謝約50％的常用臨床藥物，因此其重要性不容忽視。研究發(fā)現(xiàn)，CYP3A4個體之間酶活性具有明顯的差異。很多因素造成了CYP3A4差異化的表現(xiàn)，包括性別、藥物、內(nèi)源性物質(zhì)、環(huán)境化學物質(zhì)等。個體間在肝臟酶表達量的差異約有40倍，在藥物代謝能力方面相差也達到10倍左右。非同義單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是造成CYP3A4個體間差異達30～85％的主要遺傳因素。
　　 目前，已公布的C

3、YP3A4 SNPs多達幾十種，與野生型酶活相比，這些SNPs造成了酶活性不同程度地提高或降低。http：//www.cypalleles.ki.se上公布了CYP3A4兩種新非同義突變(F176V、I223R)，但是這兩種突變是否影響CYP3A4酶活性至今未見報道。為了研究F176V和I223R突變是否對CYP3A4酶活性造成影響，在實驗室已有CYP3A4野生型cDNA模板的基礎(chǔ)上，利用定點突變的方法分別引入兩個等位基因的突變位點，然

4、后在內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ的作用下產(chǎn)生帶有粘性末端的插入片段，此片段與同樣經(jīng)過KpnⅠ和XhoⅠ作用而帶有粘性末端的pYES2/CT載體連接，構(gòu)成的重組質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化導入大腸桿菌中。由于重組質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性標記，因此在LB-Amp平板可篩選出重組子。KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒進行初步鑒定正確后，再經(jīng)測序確認。突變引入成功的質(zhì)粒，經(jīng)過電轉(zhuǎn)將質(zhì)粒導入帶有CPR(CYP氧化還原酶)基因的酵母菌株中。經(jīng)過Western-blotti

5、ng鑒定的重組子以半乳糖大量誘導，將收獲的菌體用差速離心法制備酵母微粒體，用于酶促反應動力學以及藥物藥物相互作用(DDIs)的研究。實驗選擇的特異熒光底物DBF(Dibenzyl fluorescein)在CYP3A4的作用下去甲基化產(chǎn)生熒光產(chǎn)物。酶動力學實驗中所得數(shù)據(jù)經(jīng)過產(chǎn)物標準曲線換算，應用軟件GraphPad Prismd得到動力學參數(shù)Km、Vmax和內(nèi)在清除率CLint(CLint=Vmax/Km)，CLint是比較突變重組酶與

6、野生型重組酶代謝差異的標準。此外，我們選取了8大類八種藥物對CYP3A4野生型和兩個突變型進行了藥物抑制實驗。
　　 實驗結(jié)果顯示，兩種CYP3A4的突變重組酶均代謝DBF生成相應產(chǎn)物。但是其Km與野生型相比均有所增大，Vmax與野生型相比有所下降。F176V、I223R的CLing與野生型相比，分別為野生型的27％和22％。藥物抑制實驗結(jié)果顯示，一種藥物對不同重組酶的抑制程度不一，但是差異并不顯著；不同藥物對同種重組酶的抑制亦