抗ALV-J MF59-TLR7-8-Agonist佐劑重組Gp85蛋白疫苗的研制及對雞的免疫效果研究.pdf

1、J亞群禽白血病病毒(Subgroup J Avian leukosis Virus，ALV-J)是上世紀(jì)90年代從肉用型雞群中分離的一種由反轉(zhuǎn)錄病毒引起的高度傳染性的新型禽白血病病毒，主要引起骨髓細(xì)胞瘤。1999年我國首次從白羽肉雞中分離出該病毒。目前已出現(xiàn)大量在我國地方品系雞群以及蛋雞中關(guān)于ALV-J感染的報道。ALV-J的廣泛傳播，已給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了不可估量的潛在風(fēng)險和經(jīng)濟(jì)損失。為控制和預(yù)防ALV-J的流行，保護(hù)優(yōu)良地方品系雞，國

2、家開始對地方種雞實施種群凈化的戰(zhàn)略決策。但由于我國種雞品系和種群數(shù)量大、飼養(yǎng)不規(guī)范和飼養(yǎng)密集等特點，需要繼續(xù)加強(qiáng)對ALV-J的研究，并探索更有效的防治措施以降低各雞群的ALV-J感染率和發(fā)病率。疫苗預(yù)防對于動物性傳染病的控制，一直是一種行之有效的方法，但針對ALV-J，至今仍無有效的疫苗可在生產(chǎn)中加以應(yīng)用。因此，ALV-J疫苗的研制顯得尤為迫切。
　　本研究根據(jù)已發(fā)表的ALV-J囊膜蛋白gp85基因序列，設(shè)計一對特異性引物。從分離

3、自我國肉雞樣品的ALV-JNX0101毒株cDNA中擴(kuò)增得到目的基因，并通過PCR及測序鑒定。將gp85目的基因連接至Pet28a原核表達(dá)載體，并將鑒定確實的重組表達(dá)載體Pet28a-gp85轉(zhuǎn)化入E.coli Rosetta(DE3)菌株，IPTG適溫誘導(dǎo)后大量收獲穩(wěn)定表達(dá)的菌體蛋白，并對包涵體蛋白進(jìn)行Ni柱純化。使用ALV-J單克隆抗體，通過蛋白印跡(Western-blot)方法對重組表達(dá)蛋白進(jìn)行特異性驗證。將純化重組蛋白與不同佐

4、劑（MF59佐劑，R848佐劑和弗氏佐劑）通過超聲進(jìn)行乳化，制備多種ALV-J重組蛋白佐劑疫苗。疫苗中重組gp85蛋白含量為600μg/dose。根據(jù)免疫佐劑種類的不同，將96只海蘭褐雛雞隨機(jī)分為八組，即空白對照組、gp85-PBS組、gp85-PBS對照組、gp85-MF59組、gp85-雷西莫特組、gp85-弗氏佐劑組、gp85-MF59+雷西莫特組和gp85-弗氏佐劑+雷西莫特組。別于14和21日齡，通過腿部肌肉注射對雞群進(jìn)行免疫

5、和一次加強(qiáng)免疫。每周通過ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗，Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）檢測血清中ALV-J抗體IgG水平，加強(qiáng)免疫后進(jìn)行攻毒試驗。通過病毒血癥的檢測，評價佐劑重組蛋白疫苗的免疫保護(hù)效果。
　　結(jié)果顯示:除對照組外，各實驗組均可誘導(dǎo)產(chǎn)生一定水平的陽性抗體(S/P＞0.6);二次免疫可以增強(qiáng)免疫效果，使陽性抗體水平進(jìn)一步提高，維持時間進(jìn)一步延長;與只免疫gp85蛋白組相比，含佐劑疫

6、苗誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)更加強(qiáng)烈，特別是在早期誘導(dǎo)強(qiáng)度和抗體反應(yīng)持續(xù)時間上較顯著。MF59佐劑疫苗誘導(dǎo)的抗體水平（急劇增加，并保持時間最長）最高。更重要的是，結(jié)果表明免疫記憶可以被MF59/R848佐劑疫苗更迅速地調(diào)動起來。且免疫后三個月內(nèi)，高滴度的抗體水平仍可以在MF59/R848免疫組中被檢測到。
　　通過腹腔注射方法，將1mL102.4 TCID50 NX0101株ALV-J細(xì)胞上清液接種于上述各試驗組雞只（空白對照組隨機(jī)挑取一半數(shù)

7、量），于5周齡進(jìn)行攻毒，每7天無菌采集一次血漿進(jìn)行病毒血癥的檢測。結(jié)果顯示:各組的保護(hù)率分別為gp85+PBS組為16.7％;gp85+MF59+R848佐劑組和gp85+弗氏佐劑組為50％;gp85+MF59佐劑組為66.7％;gp85+R848佐劑組為83.3％。這些結(jié)果表明，R848佐劑疫苗免疫保護(hù)作用最強(qiáng)。同時，通過與偏于激活TH2型免疫途徑的MF59佐劑的效果進(jìn)行比較，R848作為TH1型免疫調(diào)節(jié)劑具有更好地保護(hù)力，推測外泌體