2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP),也稱自身免疫性血小板減少性紫癜(autoimmune thrombocytopenic purpura,AITP),是臨床最為常見的出血性疾病,約占出血性疾病總數(shù)的30%。本病的實(shí)質(zhì)是一種自身免疫性疾病,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,主要是由于人體自身免疫耐受機(jī)制被打破,體液免疫和細(xì)胞免疫紊亂,產(chǎn)生抗自身血小板抗體或激活細(xì)胞毒T細(xì)胞,導(dǎo)致血小板破

2、壞增加和/或生成障礙。 目前,國內(nèi)外對于ITP的一、二線治療以腎上腺皮質(zhì)激素、靜脈丙種球蛋白及脾切除為主,但仍有25%~30%的患者上述治療無效或短期內(nèi)復(fù)發(fā),成為難治性ITP,遷延不愈,甚至危及生命,對這部分患者目前有名目繁多的非常規(guī)治療比如免疫抑制劑、骨髓移植等,但是常常缺乏有效性和安全性。因此亟需探索更為有效和安全的治療方法。 自身免疫性疾病的發(fā)生主要與自身免疫耐受的破壞有關(guān),因此去除導(dǎo)致耐受破壞的因素或再次誘導(dǎo)對自

3、身抗原的耐受,有助于控制自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展。近年來研究人員從自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)理的不同角度出發(fā),開始探尋一些新型的免疫治療方法,有些方法已逐步應(yīng)用于臨床試驗(yàn)。 口服耐受(oral tolerance)是通過腸道粘膜接觸抗原而誘導(dǎo)的一種免疫應(yīng)答低下狀態(tài),是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受的重要方法之一??诜褪艿拇_切機(jī)制迄今尚不清楚,目前認(rèn)為其形成機(jī)制主要依賴于口服抗原的劑量:低劑量口服抗原可刺激調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(包括CD4+CD25h

4、igh Tr細(xì)胞、CD8+CD28-Ts細(xì)胞、NKT細(xì)胞、γδT細(xì)胞等)的分化,引起主動性免疫抑制(active suppression),其機(jī)制可能是通過分泌抑制性細(xì)胞因子(如TGF-β、IL-4、IL-10等),誘導(dǎo)以Th2和Th3應(yīng)答為主的效應(yīng),即發(fā)生“免疫偏離”。而這種主動性抑制還能作用于非特異性免疫應(yīng)答,即旁路抑制(bystander suppression);高劑量口服抗原可導(dǎo)致T細(xì)胞克隆缺失(clonal deletion

5、)和/或克隆無能(clonal anergy),誘導(dǎo)耐受的產(chǎn)生。另外,何種機(jī)制占優(yōu)勢還與口服抗原的時間、形式及次數(shù)有關(guān)??诜褪芫哂袘?yīng)用方便,無明顯毒性,且不必明確特異性自身抗原的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn),因此為治療自身免疫性疾病提供了新的途徑和思路。口服耐受應(yīng)用于T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病動物模型的防治已有不少成功的報道,如自身免疫性腦脊髓炎、膠原或佐劑誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病(NOD小鼠)、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性重癥肌無力等,且多發(fā)性硬化、

6、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎等已有臨床試驗(yàn)報道。 基于ITP的自身免疫性發(fā)病機(jī)制,應(yīng)用口服抗原誘導(dǎo)免疫耐受的研究具有可行性。已有前期研究應(yīng)用口服自身血小板治療ITP,雖然存在獲取足夠自身血小板的困難和血小板保存方法的局限,但是這種方法具備極大的潛在優(yōu)勢,如自身抗原的易接近性(血小板膜糖蛋白)、評價指標(biāo)的客觀性(血小板計數(shù))等,而且除了自身血小板,已有專家指出還可以應(yīng)用同種異體血小板、培養(yǎng)的自身血小板以及分離純化

7、的血小板糖蛋白如GPⅡb/Ⅲa。 ITP動物模型的建立有利于闡明ITP的發(fā)病機(jī)制,分析藥物的治療作用,并進(jìn)一步探討新的治療方法。一個理想的ITP動物模型應(yīng)該能模擬人類ITP的所有特點(diǎn),如易感性、發(fā)病機(jī)制和臨床過程,同時具備可操作性和穩(wěn)定性。數(shù)十年來,已有眾多的造模方法應(yīng)用于ITP的研究,如抗血小板血清及多/單克隆抗體造模方法、(NZW×BXSB)F1小鼠自發(fā)模型等。 我們參照國外有關(guān)文獻(xiàn)加以改進(jìn),用主動免疫法建立理想的I

8、TP動物模型,并通過喂食血小板抗原,研究口服耐受對ITP的防治作用,并探討其可能機(jī)制。 第一部分免疫性血小板減少(ITP)小鼠模型的建立 目的:建立ITP小鼠模型,初步探討其體液及細(xì)胞免疫機(jī)制; 方法:應(yīng)用Wistar大鼠血小板(模型組)或PBS(對照組)腹腔免疫CBA/CaJ小鼠,每周取血檢測血常規(guī),監(jiān)測血小板計數(shù)及平均血小板體積(MPV)水平的變化,并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板相關(guān)抗體(PAIgG),應(yīng)用Wes

9、tern blot技術(shù)檢測血小板洗脫抗體特異性,應(yīng)用CCK-8檢測特異性抗血小板淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng),應(yīng)用EIASA試劑盒檢測血漿IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平,同時觀察骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué),尤其是巨核細(xì)胞系的數(shù)量和發(fā)育情況。 結(jié)果:與對照組相比,模型組血小板計數(shù)于初次免疫后第3周達(dá)第一個低谷,第6周達(dá)第二個低谷(P<0.05),第8、9周降至最低(P<0.01),第10周驟然回升至正常甚至更高,MPV相應(yīng)地逐漸增大再逐漸

10、恢復(fù),而骨髓巨核細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量均無顯著變化;免疫機(jī)制研究顯示PAIgG顯著增高(P<0.05),Westernblot顯示血小板洗脫抗體可與與GPIbα(CD42b)分子量相當(dāng)?shù)牡鞍捉Y(jié)合,特異性抗血小板淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)增強(qiáng)(P<0.05);與免疫前相比,模型組血漿IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平均有所增高(P<0.05),分別于免疫后第6周、第3和7周、第4周、第4周達(dá)峰值,第10周均降至正常水平。 結(jié)論:基于抗原

11、模擬原理成功建立了理想的、穩(wěn)定的、最大程度模擬人體的ITP小鼠模型,不僅發(fā)病過程與人類ITP相似,而且發(fā)病機(jī)制亦與人類ITP相符,為ITP的實(shí)驗(yàn)研究提供了有力的工具。 第二部分小鼠GPIbα(CD42b)GST融合蛋白的原核表達(dá)及其誘導(dǎo)ITP小鼠模型口服耐受的初步研究 目的:構(gòu)建小鼠GPIbα(CD42b)原核表達(dá)載體,制備GPIba-GST融合蛋白,并探討經(jīng)口服途徑GPIbα-GST融合蛋白對ITP小鼠模型的防治作用及

12、可能機(jī)制。 方法:將小鼠GPIbα的開放讀碼框分成四個片段,片段之間有10-15個氨基酸的重疊,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增目的基因,重組到原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1中,用限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測序法進(jìn)行鑒定,IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pGexGPIbα轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3),通過SDS-PAGE、Western blot分析表達(dá)產(chǎn)物,大量表達(dá)后經(jīng)谷胱甘肽Sepharose 4B親和層析獲得純化產(chǎn)物。按不同劑量(高、中、低)將I

13、TP小鼠模型分組,每組4-6只,以灌胃針喂食實(shí)驗(yàn)小鼠純化GPIbα/GST融合蛋白(耐受組)或PBS(溶劑對照組),并設(shè)空白對照組(免疫PBS,口服PBS),觀察血小板參數(shù),檢測PAIgG以及血漿IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β水平,同時應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測外周血、脾臟及腸系膜淋巴結(jié)中CD4+CD25high 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例(%CD4+CD25high/CD4+)。 結(jié)果:限制性內(nèi)切酶酶

14、切和DNA測序分析證實(shí)成功獲得小鼠GPIba四個基因片段,并準(zhǔn)確克隆入pGEX-6P-1,pGexGPIbα經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)出分子量與理論值相符的GST融合蛋白,其中GST/GPIbα1-214和GST/GPIbα306-537為可溶性表達(dá),GST/GPIbα198-315和GST/GPIbα527-734為包涵體表達(dá),用變性復(fù)性方法獲得目的蛋白,另外免疫印跡法證實(shí)GST/GPIbα306-537能與抗小鼠GPIbα(CD42b)單克隆抗體特

15、異性結(jié)合,純化后的目的蛋白純度均達(dá)90%以上。口服耐受實(shí)驗(yàn)中,與溶劑對照組相比,高劑量耐受組血小板減少的幅度緩和,血小板降至最低的時間延遲至第10周,血小板減少的持續(xù)時間縮短至1~2周(P<0.05),MPV變化不顯著,PAIgG水平降低;調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測結(jié)果顯示與空白對照組相比,溶劑對照組各組織的%CD4+CD25high/CD4+明顯減低(P<0.05),而高劑量耐受組雖然亦有所減低,但未達(dá)顯著水平;與溶劑對照組相比,高劑量耐受組各

16、組織的%CD4+CD25high/CD4+平均水平均有所增加,但無顯著差異;血漿細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示與空白對照組相比,溶劑對照組IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平增高(P<0.01),TGF-β水平降低(P<0.01),而高劑量耐受組IL-4、IL-10水平增高(P<0.01),IFN-γ水平有所增高,IL-2、TGF-β水平有所降低,但均未達(dá)顯著水平;與溶劑對照組相比,高劑量耐受組IL-2、IFN-γ,、IL-10水平降低

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