乳鐵蛋白通過IGF-Ⅰ-IGFBPs系統(tǒng)促進(jìn)原代成骨細(xì)胞增殖與分化.pdf

1、目的:
　　觀察不同濃度的乳鐵蛋白(Lactoferrin LF)對(duì)原代大鼠成骨細(xì)胞增殖、分化及IGF-Ⅰ、IGFBP2基因表達(dá)的影響,探討乳鐵蛋白是否呈時(shí)間劑量依賴性促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化及乳鐵蛋白抗骨質(zhì)疏松的分子機(jī)制,為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　(1)采用胰酶和Ⅰ型膠原酶混合酶消化法從新生乳鼠頭蓋骨中分離原代大鼠成骨細(xì)胞,并用堿性磷酸酶染色及Ⅰ型膠原免疫組化染色鑒定。
　　(2)不同濃度乳鐵蛋白

2、干預(yù)成骨細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分組為:對(duì)照組,LF1(0.1ug/ml),LF2(1ug/ml),LF3(10ug/ml),LF4(100ug/ml),LF5(1000ug/ml),在1,3,5,7天后分別采用噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定細(xì)胞增殖,通過PNPP法測(cè)定其堿性磷酸酶活性反應(yīng)細(xì)胞分化,RT-PCR法檢測(cè)IGF-ⅠmRNA,IGFBP2mRNA的表達(dá)水平。
　　(3)利用RNA干擾技術(shù),沉默大鼠成骨細(xì)胞中IGF-Ⅰ的表達(dá)。
　　(4)

3、MTT法和PNPP法檢測(cè)乳鐵蛋白干預(yù)IGF-Ⅰ基因沉默后的大鼠成骨細(xì)胞的增殖、分化。
　　(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用x±s表示,應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,各組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P﹤0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　(1)原代培養(yǎng)的細(xì)胞具有成骨細(xì)胞的典型特征,堿性磷酸酶染色及Ⅰ型膠原免疫組化染色呈陽性。
　　(2)MTT法結(jié)果顯示:干預(yù)第一天,

4、各干預(yù)組除LF1組外均明顯高于對(duì)照組(p<0.01),各孔吸光度值隨著干預(yù)濃度的增大而升高。干預(yù)第三天,LF2、LF5組吸光度值較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),而LF3、LF4組較對(duì)照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01),干預(yù)第五天,LF2、LF3組較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),LF4組明顯高于對(duì)照組(p<0.01),LF5組則明顯低于對(duì)照組(p<0.01),干預(yù)第七天,LF2組明顯高于對(duì)照組(p<0.01),LF5組明

5、顯低于對(duì)照組(p<0.01),而LF3,LF4組雖高于對(duì)照組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí),各干預(yù)組干預(yù)1,3,5,7天,各孔的吸光度值隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)而上升。
　　(3)PNPP法結(jié)果顯示,LF1組對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性無明顯影響。LF2-5均可促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP活性。干預(yù)第七天LF5組的ALP活性值達(dá)到最大。同時(shí),各LF組ALP活性值均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷升高,且第七天顯著高于第1,3,5天。
　　(4)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

6、顯示:與對(duì)照組比較,干預(yù)1天后LF3-5組IGF-ⅠmRNA表達(dá)水平顯著升高,LF1-5組IGFBP2 mRNA水平降低(均P<0.01);3天后,LF2組IGF-ⅠmRNA表達(dá)水平升高而IGFBP2 mRNA水平降低(均P<0.05),LF3,4,5干預(yù)組較對(duì)照組IGF-ⅠmRNA表達(dá)水平明顯升高而IGFBP2 mRNA顯著降低(均P<0.01);5天后,與對(duì)照組比較,各干預(yù)組IGF-ⅠmRNA組表達(dá)量均顯著升高而IGFBP2 mRN

7、A表達(dá)量均顯著下降(P<0.01);7天后,與對(duì)照組比較,LF3,4,5組IGF-ⅠmRNA表達(dá)量明顯升高,而LF4,5組IGFBP2 mRNA表達(dá)量明顯下降,差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　(5)經(jīng)RNAi干擾使IGF-Ⅰ基因沉默后,RT-PCR結(jié)果及western blot結(jié)果顯示IGF-Ⅰ基因被沉默。
　　(6)乳鐵蛋白干預(yù)IGF-Ⅰ基因沉默后的成骨細(xì)胞,檢測(cè)其增殖、分化,結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組比較,LF

8、干預(yù)組促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化(P<0.01),shRNA轉(zhuǎn)染組,LF+shRNA轉(zhuǎn)染組抑制成骨細(xì)胞增殖、分化(P<0.01),NC組與正常對(duì)照組之間差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。shRNA轉(zhuǎn)染組及LF+shRNA轉(zhuǎn)染組與NC組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。LF+shRNA轉(zhuǎn)染組與shRNA轉(zhuǎn)染組比較差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與LF干預(yù)組比較則差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　結(jié)論: