板栗殼原花青素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬性死亡及其與凋亡的相關(guān)性研究.pdf

1、板栗殼是板栗(Castanea mollissima Bl.)加工過程中產(chǎn)生的下腳料，目前以焚燒和填埋為主，不僅對環(huán)境造成不良影響而且浪費(fèi)了寶貴的資源。本研究室發(fā)現(xiàn)板栗殼中富含原花青素(procyanidins from chestnut shell，簡稱CSPCs)，證實(shí)CSPCs具有清除自由基和抗氧化以及抗腫瘤等生物活性，并發(fā)現(xiàn)CSPCs體外除了可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡性死亡外還存在另一種死亡方式，即自噬性死亡?；诖吮菊撐囊匀烁伟〩ep

2、G2細(xì)胞為模型，采用形態(tài)學(xué)、生化和分子生物學(xué)等技術(shù)和方法，探討CSPCs誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞自噬性死亡的作用及其分子機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，研究CSPCs誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞自噬和凋亡之間的相關(guān)性，進(jìn)而揭示CSPCs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞死亡的途徑和分子機(jī)制。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.CSPCs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬性死亡及其分子機(jī)制
　　通過MTT法檢測CSPCs對HepG2細(xì)胞增殖的影響;利用MDC染色、GFP-L

3、C3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、透射電鏡觀察自噬小泡的形成與結(jié)構(gòu);檢測活性氧的產(chǎn)生、線粒體膜電位變化、細(xì)胞周期變化，研究CSPCs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬性死亡作用;通過western blot檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，研究CSPCs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬的分子機(jī)制。結(jié)果如下:
　　(1)CSPCs對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴效應(yīng)。CSPCs作用HepG2細(xì)胞6～120 h，抑制細(xì)胞增殖的ICs0在(157.5±0.57)μg/mL和

4、(84.55±0.4)μg/mL之間。
　　(2)通過形態(tài)學(xué)和生化指標(biāo)分析表明，CSPCs能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生白噬，其最佳作用時(shí)間和劑量分別為12h和300μg/mL;經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察能清晰看到自噬小體和LC3自噬蛋白熒光以及自噬小泡的結(jié)構(gòu);western blot檢測發(fā)現(xiàn)LC3蛋白表達(dá)增加，當(dāng)使用自噬抑制劑3-MA預(yù)處理細(xì)胞后，自噬受到抑制。
　　(3)CSPCs可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞阻滯于S期，并能誘導(dǎo)線粒體膜電位下降

5、，用自噬抑制劑3-MA預(yù)處理細(xì)胞后，這些現(xiàn)象都得到緩解。CSPCs作用HepG2細(xì)胞后活性氧(reactive oxygen species，簡稱ROS)產(chǎn)生量顯著增加，并存在劑量依賴性。用ROS的抑制劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，簡稱Nac)預(yù)處理后，自噬受到抑制，細(xì)胞的存活率得到提高。CSPCs誘導(dǎo)HepG2自噬性死亡可能依賴于ROS的產(chǎn)生能力，并且與線粒體途徑有關(guān)。
　　(4)PI3K/AKT/mTO

6、R信號(hào)通路參與了CSPCs誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞自噬過程。在檢測PI3K/AKT/mTOR相關(guān)蛋白和Beclin1蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)p-AKT，mTOR，PI3K的蛋白表達(dá)隨CSPCs劑量依賴性下調(diào)，Beclin1的蛋白表達(dá)隨CSPCs劑量依賴性上調(diào)。說明該自噬經(jīng)典的分子信號(hào)通路參與了HepG2細(xì)胞自噬過程。
　　2.板栗殼原花青素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)性研究
　　通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測自噬抑制劑3-MA和凋亡抑制劑Z-VAD對

7、150μg/mLCSPCs作用HepG2細(xì)胞48 h增殖的影響;利用MDC染色、GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染檢測48 h時(shí)CSPCs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬效果;通過形態(tài)學(xué)和生化指標(biāo)檢測細(xì)胞核固縮和細(xì)胞凋亡，研究自噬對凋亡的影響;通過western blot檢測自噬相關(guān)蛋白和線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)，研究CSPCs誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞白噬和凋亡關(guān)系內(nèi)在的分子機(jī)制。結(jié)果如下:
　　(1)自噬抑制劑3-MA和凋亡抑制劑Z-VAD預(yù)處理后CSPCs對腫瘤細(xì)胞

8、的增殖均有抑制作用，且均能削弱自噬作用。
　　(2)通過形態(tài)學(xué)和生化指標(biāo)分析顯示細(xì)胞核發(fā)生聚縮和裂解，產(chǎn)生“凋亡小體”，流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞增多，細(xì)胞發(fā)生凋亡。當(dāng)用3-MA和Z-VAD預(yù)處理后凋亡現(xiàn)象均得到抑制。表明自噬對凋亡具有一定影響。
　　(3)3-MA可以抑制PI3K，p-AKT和mTOR蛋白的表達(dá)量的下調(diào)。這表明下調(diào)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白可以促進(jìn)CSPCs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬，當(dāng)LC3-Ⅱ si