Yap蛋白對(duì)斑馬魚(yú)腎臟發(fā)育及腎囊腫形成的影響研究.pdf

1、[研究背景及目的]
　　多囊腎病(PKD)是一組常見(jiàn)的遺傳性腎病，其主要病理改變是雙側(cè)腎臟的各個(gè)節(jié)段形成進(jìn)行性擴(kuò)張的液性囊泡，壓迫周?chē)恼ＤI組織，導(dǎo)致腎功能衰竭，而嚴(yán)重影響患者的生活與生存。根據(jù)遺傳方式的差異，多囊腎病主要分為常染色體顯性多囊腎病(ADPKD)及常染色體隱性多囊腎病(ARPKD)。雖然研究已發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的PKD相關(guān)致病基因和可能的發(fā)病機(jī)制，但至今尚無(wú)有效的治療手段，臨床上普遍采取的僅是對(duì)癥處理。依據(jù)發(fā)病機(jī)制轉(zhuǎn)化臨

2、床治療策略已經(jīng)成為迫切需求。
　　研究表明基因突變而導(dǎo)致纖毛結(jié)構(gòu)或者功能的缺陷會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似多囊腎病的表型，而“纖毛致病假說(shuō)”也為近年來(lái)PKD的研究熱點(diǎn)之一。假說(shuō)認(rèn)為多種ADPKD和ARPKD致病基因編碼的蛋白質(zhì)分布于腎管上皮細(xì)胞的初級(jí)纖毛上，可能參與感受管腔內(nèi)的液流機(jī)械刺激以及纖毛相關(guān)蛋白的運(yùn)輸。
　　Hippo通路在果蠅及哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞中均高度保守，是調(diào)控器官組織大小的重要信號(hào)通路，通路異常與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。

3、>　　近年來(lái)研究提示Hippo通路異常，特別是其靶因子Yap表達(dá)水平及活性的改變，與腎臟異常發(fā)育及多囊腎病的發(fā)生密切相關(guān)。本科室前期研究亦表明，在雜合型Han∶ SPRD大鼠和ADPKD患者腎組織中存在YAP異常高表達(dá)及核轉(zhuǎn)位。
　　然而Yap在正常生理狀態(tài)下，是否以及如何參與腎臟發(fā)育，及對(duì)多囊腎病發(fā)生和進(jìn)展的影響機(jī)制尚有待于探索。因此，以模式生物斑馬魚(yú)為模型，通過(guò)morpholino顯微注射技術(shù)下調(diào)yap表達(dá)，觀察到其對(duì)斑馬魚(yú)前

4、腎囊腫形成，腎管發(fā)育形態(tài)，群體細(xì)胞遷移，纖毛發(fā)生的重要作用，并發(fā)現(xiàn)在多囊腎斑馬魚(yú)模型pkd2morphants（morpholino注射胚胎）過(guò)表達(dá)可磷酸化的Yap蛋白能夠顯著降低前腎囊腫比例。本研究首次闡述了Yap在體內(nèi)與纖毛發(fā)生及囊腫形成的相關(guān)性，以及抑制多囊腎病進(jìn)展的保護(hù)性作用，為多囊腎病治療提供了新的靶點(diǎn)和契機(jī)。
　　[實(shí)驗(yàn)方法]
　　一、檢測(cè)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育中的yap基因表達(dá)譜和蛋白細(xì)胞亞定位
　　應(yīng)用prim

5、er premier5.0軟件，設(shè)計(jì)針對(duì)斑馬魚(yú)Yap基因的上下游引物并合成，通過(guò)基因克隆技術(shù)構(gòu)建pCS2-yap，pTol2-8kb-EG FP-yap質(zhì)粒，T7轉(zhuǎn)錄獲得yap反義mRNA探針。收集不同發(fā)育階段的斑馬魚(yú)胚胎，通過(guò)原位雜交技術(shù)，觀察yap mRNA在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)譜，重點(diǎn)關(guān)注其在腎管及纖毛相關(guān)的器官的分布。
　　收集受精后1天(1 d.p.f)和2天斑馬魚(yú)胚胎，Dents液（80％甲醇∶20％二甲基亞砜）固定后，

6、進(jìn)行免疫熒光染色，檢測(cè)內(nèi)源性Yap蛋白的細(xì)胞亞定位;在一細(xì)胞期斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞內(nèi)注射pTol2-8kb-EGFP-yap質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座酶mRNA，收集在腎管有特異性綠色熒光的轉(zhuǎn)基因胚胎，檢測(cè)外源性Yap蛋白的細(xì)胞亞定位。
　　二、斑馬魚(yú)胚胎反義嗎啉環(huán)寡核苷酸（MO）顯微注射下調(diào)Yap表達(dá)
　　MO技術(shù)目前已廣泛運(yùn)用于生物發(fā)育中基因功能研究。其序列通過(guò)堿基互補(bǔ)能與特定的mRNA結(jié)合形成雙鏈物有效阻止mRNA的成熟或蛋白質(zhì)翻譯。本研究

7、根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，合成獲得特異性結(jié)合斑馬魚(yú)yap5'端非翻譯區(qū)(UTR)的MO序列，注射到一細(xì)胞期斑馬魚(yú)胚胎卵黃中獲得下調(diào)Yap表達(dá)，并通過(guò)免疫印跡(western blotting)檢測(cè)Yap蛋白表達(dá)變化，及表型回復(fù)實(shí)驗(yàn)明確MO的有效性和特異性。
　　三、觀察yap對(duì)斑馬魚(yú)腎管發(fā)育，細(xì)胞遷移，細(xì)胞極性，纖毛生成的影響
　　觀察yap morphant不同胚胎發(fā)育時(shí)期大體表型改變;通過(guò)轉(zhuǎn)基因魚(yú)Tg(Na+/K+ATPase∶

8、EGFP)觀察yap morphant前腎發(fā)育的改變;原位雜交檢測(cè)yap morphant前腎腎管不同節(jié)段標(biāo)記探針的表達(dá)差異，了解腎管群體細(xì)胞遷移的改變;免疫熒光檢測(cè)yap morphant腎管頂?shù)锥思?xì)胞極性的改變;免疫熒光檢測(cè)yap morphant纖毛形態(tài)的變化，以及在纖毛發(fā)生過(guò)過(guò)程中基體向頂端膜遷移過(guò)程的改變;顯微共注射觀察Yap與纖毛相關(guān)基因促進(jìn)斑馬魚(yú)前腎囊腫形成的協(xié)同效應(yīng)。
　　四、觀察斑馬魚(yú)中Yap與多囊蛋白2(pol

9、ycystin-2，PC-2)之間的相互關(guān)系
　　通過(guò)顯微共注射觀察在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育中yap與ADPKD致病基因pkd2在前腎囊腫形成過(guò)程中存在基因互作效應(yīng);而在pkd2 morphants中過(guò)表達(dá)全長(zhǎng)yapmRNA和磷酸化位點(diǎn)突變的yapS127A mRNA，觀察對(duì)前腎囊腫形成比例的影響。
　　五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　所有結(jié)果以(x)±s表示，數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及制圖。方差齊性采

10、用非配對(duì)t檢驗(yàn)，方差非齊性則采用秩和檢驗(yàn)。多組間分析采用one way ANOVA。P＜0.05為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
　　一.yap在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育中的表達(dá)定位研究
　　原位雜交顯示，在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育中yap是母源表達(dá)基因，合子基因表達(dá)從中囊胚過(guò)度時(shí)期(MBT)開(kāi)始，在最早于6體節(jié)期(S)可見(jiàn)于側(cè)板中胚層(LPM)和中間中胚層(IM)分布，而后在19s，24 hpf,48 hpf,72 hpf均在

11、前腎腎管中有表達(dá)，此外在纖毛相關(guān)器官眼，耳，腦中也有分布。
　　運(yùn)用Yap抗體進(jìn)行免疫熒光顯示內(nèi)源性Yap蛋白明顯分布于斑馬魚(yú)腎管，其細(xì)胞亞定位為在腎管上皮細(xì)胞頂端膜及胞漿聚積;而在腎管特異性過(guò)表達(dá)EGFP-Yap融合蛋白，顯示的細(xì)胞亞定位與內(nèi)源性蛋白免疫熒光結(jié)果一致。
　　二.yap對(duì)斑馬魚(yú)腎管發(fā)育，細(xì)胞遷移，細(xì)胞極性的影響
　　ap morphants在胚胎發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)心包水腫，腦水腫，前腎囊腫，體軸輕微彎曲，小

12、眼，短體等表型，且這些表型能夠通過(guò)過(guò)表達(dá)全長(zhǎng)的yap mRNA獲得一定程度的回復(fù)，前腎囊腫比例顯著下降，而過(guò)表達(dá)磷酸化位點(diǎn)突變的yapS127A mRNA，前腎囊腫比例改變沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg(Na+/K+ATPase∶EGFP)可觀察腎管發(fā)育各階段的變化，發(fā)現(xiàn)yap morphants在24 hpf腎管泄殖腔可見(jiàn)閉合異常及膨大擴(kuò)張，其比例約15％，從48 hpf開(kāi)始可見(jiàn)6.7％的腎管出現(xiàn)中斷，其比例隨時(shí)間推移明顯增加，至7

13、2 hpf可達(dá)到26％，分別通過(guò)cldh17探針原位雜交和α-6F抗體免疫熒光觀測(cè)72 hpf胚胎前腎腎管全長(zhǎng)，均可見(jiàn)同轉(zhuǎn)基因魚(yú)顯示的腎管中斷現(xiàn)象，而泄殖腔形態(tài)異常的比例隨胚胎發(fā)育沒(méi)有明顯改變，此外腎管總體長(zhǎng)度變短，前端的彎曲消失，提示腎管群體細(xì)胞遷移異常;24 hpf胚胎PCNA抗體免疫熒光顯示腎管遠(yuǎn)端細(xì)胞增殖無(wú)明顯異常;分別通過(guò)斑馬魚(yú)前腎腎管節(jié)段特異性的標(biāo)記探針進(jìn)行原位雜交，可見(jiàn)在24 hpf胚胎wt1b，slc4a4a，trpm-

14、7，slc12a1，slc12a3，evx1的表達(dá)均沒(méi)有明顯改變，說(shuō)明細(xì)胞命運(yùn)并沒(méi)有改變;而觀測(cè)72 hpf胚胎，可見(jiàn)wt1b標(biāo)記的腎小球形成囊腫樣擴(kuò)張，slc4a4a標(biāo)記的腎管前端“發(fā)夾”樣彎曲消失，遷移明顯滯后，且在slc4a4a+，trpm-7+和slc12a1+細(xì)胞節(jié)段可見(jiàn)腎管中斷，泄殖腔標(biāo)記探針evx1表達(dá)下調(diào)甚至消失;免疫熒光顯示yap morphants頂?shù)锥四ぜ?xì)胞極性存在異常，頂端膜標(biāo)記蛋白aPKC分布無(wú)明顯異常，而側(cè)基

15、底膜標(biāo)記蛋白α-6F在基底膜分布減少，并在頂端膜也存在定位。
　　三.yap對(duì)斑馬魚(yú)纖毛形成的影響
　　yap morphants存在多種類(lèi)“纖毛病”表型，而眼及腎管的纖毛形態(tài)存在缺陷:眼部外層纖毛明顯變短甚至缺失;腎管中段多纖毛區(qū)明顯變少，或被單纖毛取代，而后段單纖毛數(shù)量(20.3±1.5 vs對(duì)照組30.3±2.7; n=175，P＜0.01)和長(zhǎng)度（3.9±0.2μm vs對(duì)照組6.2±0.2μm; n=175，P＜0

16、.001）顯著變短;腎管多纖毛基體非正常的線性排列，而變?yōu)閳F(tuán)狀簇?fù)恚@可能是影響多纖毛束形成;部分多纖毛和單纖毛基體在擴(kuò)張的腎管中亦未完全遷移至頂端膜，影響纖毛的發(fā)生。原位雜交檢測(cè)纖毛主宰基因foxj1a，發(fā)現(xiàn)在24 hpf和72 hpf的yap morphants胚胎表達(dá)均上調(diào)，因在野生型及yap morphants中過(guò)表達(dá)foxj1a mRNA并未對(duì)纖毛結(jié)構(gòu)有明顯影響，考慮yap morphants胚胎中foxj1a表達(dá)是反饋性上調(diào)

17、。而檢測(cè)多纖毛標(biāo)記探針shippo1發(fā)現(xiàn)在72 hpfyap morphants胚胎存在分布的異常。此外，顯微共注射實(shí)驗(yàn)證實(shí)斑馬魚(yú)中yap分別與纖毛蛋白運(yùn)輸相關(guān)基因ift20，ift88和arl13b在前腎囊腫形成的通路上存在協(xié)同互作效應(yīng)。
　　四.Yap與多囊蛋白2(PC-2)的基因互作效應(yīng)，以及過(guò)表達(dá)可磷酸化Yap蛋白對(duì)pkd2 morphants前腎囊腫生成的保護(hù)性作用
　　在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育中yap與ADPKD致病基因

18、pkd2在前腎囊腫形成過(guò)程中存在基因互作效應(yīng)，在低濃度yap MO和pkd2 MO共注射胚胎產(chǎn)生前腎囊腫的比例遠(yuǎn)大于單獨(dú)MO注射胚胎，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在pkd2 morphants中過(guò)表達(dá)全長(zhǎng)yap mRNA能夠顯著降低其前腎囊腫形成的比例，但是在pkd2 morphants中過(guò)表達(dá)磷酸化位點(diǎn)突變的yapS127A mRNA沒(méi)有表型回復(fù)效果。
　　[結(jié)論]
　　1.在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育中yap mRNA在前腎腎管中有持續(xù)

19、表達(dá)，而Yap蛋白在腎管上皮細(xì)胞頂端膜及胞漿聚積。
　　2.在斑馬魚(yú)胚胎下調(diào)ap表達(dá)會(huì)出現(xiàn)心包水腫，腦水腫，前腎囊腫，體軸輕微彎曲，小眼，短體等類(lèi)似“纖毛病”的表型。
　　3.yap morphants前腎腎管各個(gè)節(jié)段的細(xì)胞群體遷移存在缺陷。
　　4.yap morphants前腎腎管的側(cè)基底膜細(xì)胞極性存在異常，向頂端膜分布。
　　5.yap morphants眼及腎管的纖毛形態(tài)存在缺陷，腎管多纖毛基體的排列和單