耐有機溶劑地衣芽孢桿菌YP1產溶劑穩(wěn)定性蛋白酶的研究.pdf

1、耐有機溶劑極端微生物在雙相生物催化轉化、環(huán)境生物修復、極端酶系開發(fā)等領域具有重要用途。耐有機溶劑極端微生物所產生的天然耐有機溶劑酶系如蛋白酶及酯酶在有機溶劑中對某些手性化合物表現(xiàn)出高度的立體選擇性，使它們在手性化合物的拆分及催化合成等方面顯示出廣闊的應用前景。本論文根據耐有機溶劑極端菌產生天然耐有機溶劑酶系的研究現(xiàn)狀，將研究重點放在耐有機溶劑極端菌的篩選、高強度耐有機溶劑蛋白酶產生菌的篩選及生物學特征、耐有機溶劑蛋白酶的酶學性質及基因表

2、征等研究。本文的主要研究成果如下：
　　 (1)以環(huán)己烷、甲苯、丙酮、丁醇等溶劑為選擇壓力，從土壤樣品中篩選獲得43株耐有機溶劑菌。經鑒定，以環(huán)己烷、甲苯為選擇壓力篩選的36株菌，多為革蘭氏陰性菌Pseudomonas屬細菌；而由丙酮、丁醇混合溶劑篩選的7株菌均為革蘭氏陽性菌株，其中5株為Bacillus屬細菌。研究了43株候選菌株對10種溶劑(logP-2.03-5.6)的耐受特性，結果表明，革蘭氏陰性菌對溶劑的耐受能力普遍高

3、于革蘭氏陽性菌株，以辛醇、十二醇為代表的長鏈烷醇對革蘭氏陽性菌的細胞毒性尤為顯著。43株耐有機溶劑菌的抗生素耐受性試驗顯示了明顯的規(guī)律性，即所有革蘭氏陰性菌對氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素及氯霉素均不敏感，而革蘭氏陽性菌對上述4種抗生素均敏感，這一現(xiàn)象可能與細胞壁膜的通透性差別或膜蛋白特性有關。
　　 (2)從43株耐有機溶劑極端菌篩選耐有機溶劑蛋白酶產生菌，獲得8株菌株能相對高產胞外蛋白酶。其中2菌株所產胞外蛋白酶具有對高濃度親

4、水溶劑(二甲基亞砜(DMSO)，二甲基甲酰胺(DMF))穩(wěn)定的特質，分別為Bacilluslicheniformis YP1和Pseudomonas aeruginosa YYP6，其中Bacillus licheniformisYP1為首次報道產溶劑穩(wěn)定性蛋白酶的菌株，用于后續(xù)的研究。
　　 (3)溶劑可顯著影響YP1菌株產胞外蛋白酶的能力。烷烴溶劑的碳鏈長度對YP1菌株產酶呈現(xiàn)了顯著差異，正庚烷、正辛烷、正癸烷等溶劑顯著抑制

5、YP1產蛋白酶，而十二烷、十四烷、十六烷能顯著促進蛋白酶分泌產量提高1倍以上。烷醇均能顯著抑制YP1產胞外蛋白酶，C6以上的烷醇溶劑對YP1菌株的細胞毒性顯著高于相應的烷烴溶劑。分析十四烷和十二醇對YP1細胞形態(tài)的影響可見，十四烷存在下能增加細胞的比表面積，而十二醇存在下導致了細胞比表面積的減小，推測與溶劑的細胞毒性差異有關。
　　 (4)分離純化得到電泳純的YP1耐有機溶劑蛋白酶，并對其酶學性質進行了表征。通過硫酸銨沉淀、疏水

6、及強陽離子交換層析，得到電泳純的YP1蛋白酶，比活力提高了37.2倍，總蛋白回收率達20％。分離純化產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)顯示亞基分子質量約為28 kDa，以酪蛋白為底物時，YP1蛋白酶的Km為0.048g/L。純化的YP1蛋白酶對高達50％(v/v)濃度的12種有機溶劑具有高度的穩(wěn)定性，尤其對親水性溶劑DMF和DMSO的最大耐受濃度分別高達55％和65％(v/v)，揭示其具有良好的有機相催化潛力。YP1蛋白酶在p

7、H8.0-13.0內的具有較高活力和穩(wěn)定性，最適反應pH為10.0，為迄今報道的最耐堿的溶劑穩(wěn)定性蛋白酶；YP1蛋白酶最適反應溫度為55℃，45℃以下時具有良好的穩(wěn)定性。還原劑對酶活有輕微的抑制作用，低濃度變性劑尿素(Urea)對酶活具有較強的促進作用。YP1蛋白酶具有絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶的特性，對表面活性劑Triton、SDS、Tween等均具有較強的抗性。YP1蛋白酶的耐堿特性及對表面活性劑的抗性，揭示其具有洗滌劑添加領域的應用

8、潛力。
　　 (5)克隆了YP1耐有機溶劑蛋白酶基因，并在Bacillus subtilus WB800中進行表達，驗證了表達蛋白的溶劑耐受性。克隆了包括啟動子、信號肽的蛋白酶基因，B.licheniformis YP1堿性蛋白酶的閱讀框與B.licheniformis ATCC14580菌株堿性蛋白酶kerA的堿基同源性為96.4％，氨基酸同源性為98.7％，其氨基酸突變位點共有5個，其中Glu85→Lys85的改變發(fā)生在YP

9、1蛋白酶的前肽序列，成熟蛋白酶的氨基酸變化共有4處，分別為Tyr126→Phe126，Asn199→Ser191，Pro233→Ala233，Ser316→Asn316。采用枯草桿菌克隆載體pHY300PLK，利用YP1蛋白酶自身的啟動子、RBS、信號肽、前肽、成熟肽等功能序列在B.subtilus WB800中進行了表達，重組菌能正確識別并分泌表達YP1蛋白酶，培養(yǎng)基上清中蛋白酶活力高達150U，是含有pHY300PLK空載體對照菌株