水稻小RNA的基因組分布和分子進化研究.pdf

1、多數(shù)真核生物都包含多種以小RNA(small RNA)為核心的基因沉默途徑，其在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上對基因、重復序列和病毒等進行負調(diào)控。隨著實驗和計算生物學技術(shù)的發(fā)展，在植物中發(fā)現(xiàn)了越來越多的小RNA。目前已知有2種主要的小RNA，分別是微RNA(microRNA，miRNA)，小干擾RNA(small interferingRNA，siRNA)，各自都具有不同的生物合成模式和基因組座位。小RNA的產(chǎn)生位點，尤其是產(chǎn)生24-nt小干擾RN

2、A的位點，和基因組中的重復序列高度相關(guān)。在植物小RNA途徑中，已發(fā)現(xiàn)有許多蛋白組分的參與，比如：RNA依賴性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RDR)，類Dicer酶(Dicer-like enzyme，DCL)，基因沉默抑制子(Supressor of Gene Silencing，SGS)和Argonaute(AGO)等。所有小RNA介導的基因沉默途徑都需要AGO家族成員的參與。新的測序技術(shù)使得

3、對小RNA群體有效深入的測序成為可能，在植物中已有多項小RNA測序計劃開展，幫助人們發(fā)現(xiàn)新的小RNA種類和基因，并對小RNA的表達進行分析。雖然對小RNA的多樣性，產(chǎn)生機制和功能的研究很多，但是對其進化過程的了解還不多?；蚪M倍增是進化的重要驅(qū)動力，產(chǎn)生了大量基因家族和新基因。多種生物，比如酵母、脊椎動物、擬南芥和禾本科均經(jīng)歷了古老的基因組倍增事件。最近的研究發(fā)現(xiàn)，倍增或復制事件在擬南芥若干miRNA家族(比如miR169和miR395

4、)的分化和進化過程中扮演了重要角色。 本研究利用分子生物學和計算生物學方法，主要研究了禾本科重要的模式植物，水稻的兩個典型小RNA家族(TAS3和miR156)的進化過程及其小RNA在水稻基因組上的分布與表達分化。 反式作用siRNA(trans-acting siRNA，tasiRNA)是長為21 nt的植物特異性內(nèi)源性siRNA，與目標位點非完全互補結(jié)合后，誘導對靶基因的剪切反應。每個tasiRNA基因座位(TAS基

5、因)轉(zhuǎn)錄后被轉(zhuǎn)變成dsRNA，然后以21 nt為步長，進行相位(phase)式切割，生成tasiRNA，這個過程需要SGS3/RDR6/DCL4途徑的參與。在tasiRNA的形成過程中，需要miRNA的參與來錨定切割的目標序列區(qū)域。已經(jīng)鑒別了植物上來自4個TAS基因家族(TASl-TAS4)的10多個TAS3基因，包括擬南芥中的TAS1-TAS4和水稻中的TAS3基因。來自TAS3家族的tasiRNA，tasiARF對編碼生長素應答因子

6、(Auxin Response Factors，AREs)，包括ARF2，ARF3和ARF4的mRNA有下調(diào)作用，并且在營養(yǎng)枝發(fā)育和葉極性的時序性調(diào)控中也發(fā)揮作用。TAS3家族和其他已經(jīng)識別的TAS基因座位至少在兩方面有所不同：(1)在雙子葉(擬南芥)，單子葉(水稻)，甚至在裸子植物中(苔蘚)中，TAS3都需要兩個miR390結(jié)合位點；(2)miR390在植物界中相當保守。TAS3在水稻和擬南芥上的高度保守性，為通過計算識別的方法在其他

7、植物上發(fā)現(xiàn)候選的TAS3基因提供了可能。這些基因序列可用來分析TAS3家族在禾本科以及其他植物中的進化。本研究通過數(shù)據(jù)庫挖掘和PCR擴增識別了56個候選TAS3基因。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，在禾本科中，TAS3基因的擴張至少經(jīng)歷了3次基因組/基因倍增事件，并且許多TAS3基因已經(jīng)在進化中丟失。我們的結(jié)果呈現(xiàn)了在基因組倍增事件背景下，禾本科中TAS3家族基因在進化中頻繁生滅的歷史。同時，序列分析表明在tasiARF和3' miR390互補位點之

8、間的區(qū)域上，TAS3基因序列的相位排布結(jié)構(gòu)具有高度的保守性，也就是說，這個區(qū)域長度的變化遵守以21 nt為單位的規(guī)則。我們還在水稻和擬南芥的miR390靶標LRR激酶基因中找到了類似TAS3的序列。在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們對TAS3基因的起源和產(chǎn)生機制進行了探討。 miRNA是長約21-24 nt的小RNA分子，最初作為pri-miRNA(primarymiRNA)的一部分由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，pri-miRNA經(jīng)加工后形成具莖

9、環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體(pre-miRNA)，然后由DCL進一步加工為成熟miRNA。miRNA通過介導對目標基因的降解或翻譯抑制而產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后水平上的基因沉默功能。在水稻中，通過克隆或計算識別，也已發(fā)現(xiàn)了幾百個miRNA。對擬南芥中含多成員的miRNA家族的進化研究發(fā)現(xiàn)，倍增或復制事件在這些miRNA家族的分化和進化過程中扮演了重要角色。miR156家族是植物中最早被鑒定的miRNA家族之一。這個家族在水稻中有12個成員，在45個不同的

10、植物中均發(fā)現(xiàn)了miR156，且其在植物界中高度保守。研究表明，miR156的靶基因為SPL，是一種包含SBP盒的植物特異性轉(zhuǎn)錄因子。在位于水稻6條染色體上的12個miR156家族成員中，miR156b和miR156c基因(以下稱為MIR156b/c)是位于1號染色體上的串聯(lián)基因。一個全長cDNA(AK110797)同時編碼這兩個miRNA。miR156b的過表達導致水稻和玉米中的多分蘗和叢生性狀。序列分析表明，MIR156b/c基因座位

11、在禾本科作物中具有高度保守性，但是在雙子葉植物中并不保守。同時，基因組倍增事件在miR156家族的進化過程中有重要影響。本研究對30個栽培稻和15個野生稻的MIR156b/c座位進行了測序。遺傳多樣性研究表明，栽培稻中MIR156b/c基因座位只保留了野生稻(Oryza rufipogon)約9％的核苷酸多樣性。Tajima's D檢驗以及Fu and Li's D*和F*檢驗的結(jié)果拒絕了中性假設(shè)(P<0.05)，表明MIR156b/c

12、基因座位在O.rufipogon中受到了顯著的自然選擇。在栽培稻中檢測到強的正向選擇信號，表明栽培稻也經(jīng)歷了顯著的自然或馴化選擇過程。 為了獲得水稻小RNA在基因組水平上的分布等特征，我們對前期所測定的680多萬條水稻種子發(fā)育過程中產(chǎn)生的小RNA序列在水稻基因組上的分布和表達等進行了分析。結(jié)果表明，小RNA主要產(chǎn)生于重復序列和基因間隔區(qū)，且基因組不同區(qū)域上小RNA的產(chǎn)生量有非常大的差異，提示小RNA的產(chǎn)生有基因組區(qū)域上的特異性。