雌、雄激素對(duì)去卵巢雌鼠淚液分泌及淚腺中Bax，bcl-2表達(dá)的影響和淚腺中TGF-β-,1-、MMP-2及其抑制劑TIMP-2表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、眼表（角膜、結(jié)膜、副淚腺和瞼板腺）、主淚腺和它們之間的神經(jīng)放射環(huán)由于其密切的解剖和功能聯(lián)系構(gòu)成一個(gè)整體功能單位，稱為“眼表淚腺反饋系統(tǒng)”。它們共同發(fā)揮對(duì)淚液分泌和淚膜形成的調(diào)控作用，維護(hù)眼表健康，任一環(huán)節(jié)的損害均可導(dǎo)致淚膜完整性和功能的破壞，從而導(dǎo)致干眼。干眼的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前認(rèn)為主要與炎癥、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制異常和性激素水平失調(diào)等因素相關(guān)。干眼常發(fā)生于老年女性，性激素被認(rèn)為是其發(fā)病機(jī)制之一。在絕經(jīng)后的婦女，內(nèi)分泌變化是干眼發(fā)

2、生的重要因素，然而是由于雌激素過(guò)剩還是不足、雄激素的缺乏和/或雌、雄激素之間的不平衡影響眼表功能尚有爭(zhēng)議，哪些因素起主要作用仍不清楚。
　　 細(xì)胞凋亡（apoptosis）是一種特殊的細(xì)胞死亡類型，指細(xì)胞在一定的生理或者病理?xiàng)l件下，遵循自身固有程序結(jié)束生命的現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡是一種正常的生理現(xiàn)象，通過(guò)凋亡，機(jī)體清除感染和損傷，維持機(jī)體正常生理功能。然而，在一定條件下，細(xì)胞凋亡又是一種病理現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡受多種信號(hào)的協(xié)同調(diào)控，其中最重要

3、的調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的因子是bcl-2和它相關(guān)的基因。細(xì)胞凋亡在免疫性疾病中起到十分重要的作用。干眼淚腺和眼表上皮細(xì)胞的凋亡異常增加，而局部組織中的淋巴細(xì)胞的凋亡卻被抑制。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)受細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、性激素、神經(jīng)激素、細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞間交互作用和細(xì)胞轉(zhuǎn)化等多種因素的調(diào)節(jié)。已證實(shí)性激素在許多組織中調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的合成，全身性和非全身性干燥綜合癥（SS）病人淚液和唾液中MMP-2和MMP-9

4、均增加，在不同的SS鼠模型中也是如此，淚腺炎癥誘導(dǎo)的兔干眼模型淚腺和角膜中MMP-2和MMP-9也同樣升高，認(rèn)為MMPs可能是本病的發(fā)病機(jī)理。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）是一類具有多種生物活性的細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等多種功能，是免疫系統(tǒng)的主要抑制性分子。TGF-β1刺激細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）如膠原蛋白、纖維連接蛋白、層粘蛋白和蛋白多糖的合成，抑制基質(zhì)蛋白酶的產(chǎn)生，促進(jìn)調(diào)節(jié)各種細(xì)胞連接蛋白受體的表達(dá)及ECM成分與這些受體的

5、結(jié)合。然而關(guān)于性激素調(diào)節(jié)淚腺中MMP-2及其抑制劑TIMP-2表達(dá)，以及與TGF-β1的相互關(guān)系卻不清楚。以往研究表明：17β-雌二醇促進(jìn)人角膜上皮細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子和MMPs的表達(dá)，而MMPs與干眼癥又有非常密切的關(guān)系。近些年，性激素在干眼中的作用逐漸引起人們的重視，成為研究的熱點(diǎn)。
　　 為此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了通過(guò)對(duì)雌性性成熟Wistar大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)（OVX），模擬人工絕經(jīng)狀態(tài)，給予大鼠雌、雄激素全身及局部治療，觀察血清雌

6、、雄激素水平、淚液分泌量、淚膜穩(wěn)定性、大鼠淚腺和眼表組織學(xué)的變化，檢測(cè)淚腺中凋亡基因Bax、bcl-2、TGF-β1因子表達(dá)及MMP-2及其抑制劑TIMP-2的表達(dá)，探討雌、雄激素對(duì)去卵巢雌鼠淚液分泌及淚腺功能的影響及其作用機(jī)制，為臨床醫(yī)生應(yīng)用雌、雄激素治療絕經(jīng)期婦女干眼提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)分為三部分。
　　 第一部分雌、雄激素對(duì)去卵巢雌鼠淚液分泌及眼表和淚腺組織病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)改變的影響
　　 目的：探討雌、

7、雄激素對(duì)去卵巢雌鼠淚液分泌及眼表和淚腺組織病理和超微結(jié)構(gòu)改變的影響。
　　 方法：雌性性成熟Wistar大鼠64只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組8只、假手術(shù)組8只、實(shí)驗(yàn)組48只。假手術(shù)組僅打開(kāi)腹腔，切除部分脂肪，實(shí)驗(yàn)組行雙側(cè)OVX。術(shù)后5個(gè)月將實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組、實(shí)驗(yàn)4組、實(shí)驗(yàn)5組、實(shí)驗(yàn)6組，每組8只大鼠。自術(shù)后第5個(gè)月起，實(shí)驗(yàn)1組不予任何干預(yù)，實(shí)驗(yàn)2組給予粟米油100ul皮下注射每3天一次，實(shí)驗(yàn)3組給予苯甲酸雌二

8、醇200ug/kg皮下注射每3天一次，實(shí)驗(yàn)4組給予苯甲酸雌二醇點(diǎn)眼，每日4次，實(shí)驗(yàn)5組給予3.75mg/kg丙酸睪丸酮肌肉注射每3天一次，實(shí)驗(yàn)6組給予2.5％丙酸睪丸酮點(diǎn)眼，每日4次。分別于術(shù)前、術(shù)后第1、2、3、4、5個(gè)月及給藥后6周，測(cè)大鼠淚液分泌量（SⅠt）、淚膜破裂時(shí)間（BUT）及角膜熒光素鈉染色情況。給藥6周后處死動(dòng)物，立刻取所有大鼠淚腺、角膜和結(jié)膜，行眼表和淚腺組織病理學(xué)和透射電鏡檢查。分別于術(shù)前、術(shù)后第5個(gè)月及給藥后6周測(cè)

9、大鼠血清雌二醇和睪酮水平。
　　 結(jié)論：
　　 1.通過(guò)OVX模擬人工絕經(jīng)狀態(tài)，去卵巢雌鼠血清中雌、雄激素水平均較術(shù)前降低，淚液分泌減少，淚膜穩(wěn)定性下降。全身補(bǔ)充雄激素使淚液分泌量增加，淚膜穩(wěn)定性提高；全身補(bǔ)充雌激素使淚液分泌量減少，淚膜穩(wěn)定性下降。推測(cè)OVX引起的淚液分泌減少與血清雄激素水平下降有關(guān)。
　　 2.全身補(bǔ)充雄激素能夠改善由于OVX術(shù)后出現(xiàn)的淚腺萎縮，緩解眼表?yè)p害，促進(jìn)淚液分泌，改善淚膜穩(wěn)定性。

10、r>　　 3.全身補(bǔ)充雌激素加重淚腺萎縮及眼表?yè)p害，減少淚液分泌，破壞淚膜穩(wěn)定性。提醒臨床醫(yī)生應(yīng)慎用激素替代療法。
　　 第二部分雌、雄激素對(duì)去卵巢雌鼠淚腺中凋亡基因Bax，bcl-2表達(dá)的影響
　　 目的：探討雌、雄激素對(duì)去卵巢雌鼠淚腺中凋亡基因Bax、bcl-2表達(dá)的影響。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組同第一部分。給藥6周后處死動(dòng)物，立刻摘取大鼠淚腺，采用免疫組化（SP法）觀察淚腺上皮細(xì)胞凋亡率及凋亡基因Ba

11、x和bcl-2的表達(dá)。
　　 結(jié)論：正常大鼠淚腺上皮中存在Bax的表達(dá)，OVX術(shù)后淚腺上皮細(xì)胞中Bax表達(dá)增加，bcl-2表達(dá)減少，淚腺上皮細(xì)胞凋亡可能是去卵巢雌鼠淚液分泌減少的作用機(jī)制之一。全身應(yīng)用雌激素加重去卵巢大鼠淚腺上皮細(xì)胞凋亡，全身應(yīng)用雄激素減輕去卵巢大鼠淚腺上皮細(xì)胞凋亡。提示雄激素通過(guò)改善淚腺上皮細(xì)胞凋亡，使淚液分泌量增加，淚膜穩(wěn)定性提高，眼表?yè)p害減輕；雌激素與之作用相反。
　　 第三部分雌、雄激素對(duì)去卵巢雌

12、鼠淚腺中TGF-β1、MMP-2及其抑制劑TIMP-2表達(dá)及其相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：探討雌、雄激素對(duì)去卵巢雌鼠淚腺中MMP-2及其抑制劑TIMP-2的表達(dá)的影響及TGF-β1的表達(dá)變化，并對(duì)TGF-β1、MMP-2及TIMP-2進(jìn)行相關(guān)性分析，進(jìn)一步探討MMP-2及TIMP-2在干眼中的作用機(jī)制。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組同第一部分。給藥6周后處死動(dòng)物，立刻摘取大鼠淚腺，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)MMP-2mRN

13、A和TIMP-2mRNA水平，采用Western-blot方法檢測(cè)淚腺中MMP-2蛋白含量的變化，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)淚腺中TGF-β1的質(zhì)量濃度。
　　 結(jié)論：
　　 1.OVX術(shù)后淚腺中MMP-2mRNA和TIMP-2mRNA水平較正常組增加；雌激素上調(diào)淚腺中MMP-2mRNA和TIMP-2mRNA水平；雄激素下調(diào)淚腺中MMP-2mRNA和TIMP-2mRNA水平；且MMP-2與TIMP-2間有相關(guān)

14、關(guān)系。
　　 2.OVX術(shù)后淚腺中MMP-2蛋白的表達(dá)較正常組增加；雌激素上調(diào)淚腺中MMP-2蛋白的表達(dá)；雄激素下調(diào)淚腺中MMP-2蛋白的表達(dá)。
　　 3.雄激素促進(jìn)去卵巢雌鼠淚腺中TGF-β1的表達(dá)。
　　 4.推測(cè)雌激素通過(guò)上調(diào)淚腺中MMP-2的水平導(dǎo)致淚液分泌減少，淚膜穩(wěn)定性下降，雄激素與之作用相反，一方面通過(guò)增加TGF-β1的含量，抑制淚腺的免疫反應(yīng)，另一方面，通過(guò)抑制MMP-2的表達(dá)，改善干眼的淚液分泌