含活基質(zhì)細胞的去上皮羊膜促進角膜上皮干細胞特性的維持和擴增.pdf

1、角膜上皮干細胞存在于角膜緣基底部,嚴重眼表面疾病常導致角膜上皮干細胞缺乏,造成患者嚴重視功能障礙甚至失明。角膜上皮干細胞體外擴增和移植是目前治療嚴重角膜上皮干細胞缺乏的有效方法。理想的角膜上皮干細胞體外擴增技術(shù)是在體外模擬角膜上皮干細胞所處的微環(huán)境,以保持干細胞的特性并促進干細胞的增殖。迄今已有不同技術(shù)用于體外擴增角膜上皮干細胞,包括采用不同的載體,經(jīng)過不同處理的供體細胞,以及不同的培養(yǎng)基等。到目前為止還沒有建立一個標準化的角膜上皮干細

2、胞體外擴增技術(shù)。
　　 目的:羊膜作為一種載體,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于角膜上皮干細胞的體外擴增。一般認為,在體外,它可能作為一種干細胞的替代微環(huán)境。先前的研究使用有或無上皮的冷凍保存羊膜作為載體,其中不含羊膜來源的活細胞。本研究擬探討含活細胞的羊膜基質(zhì)是否可以發(fā)揮微環(huán)境作用,以促進角膜上皮干細胞的體外擴增。
　　 方法:新鮮羊膜組織經(jīng)過DispaseⅡ37℃短暫消化后刮除上皮細胞,固定于insert環(huán)上,一部分羊膜于-80℃反復(fù)

3、凍融至少三次使基質(zhì)細胞死亡作為對照組(D-dAM),另外一部分羊膜未作任何處理放入SHEM培養(yǎng)基中為實驗組(L-dAM)。從經(jīng)DispaseⅡ消化過的兔角膜緣組織塊上分離兔角膜緣上皮細胞片,并轉(zhuǎn)移到去上皮羊膜基質(zhì)上培養(yǎng)大約7天。一部分組織塊在培養(yǎng)前行BrdU標記,并示蹤培養(yǎng)7天,一部分培養(yǎng)3天后進行標記且不行示蹤培養(yǎng)。收集擴增的上皮細胞以3T3細胞為滋養(yǎng)層進行克隆培養(yǎng)。在羊膜表面擴增的細胞分別行K12,K14,p63,Ki67的whol

4、e-mount和切片染色,以及Ⅳ型膠原、Ⅶ型膠原的切片免疫熒光染色。同時,收集上皮細胞,用蛋白印跡法檢測K12,K14,p63,Ki67的表達。在不用任何消化處理情況下,用刮刀刮取L-dAM和D-dAM上擴增的上皮片,以備移植。
　　 結(jié)果:在L-dAM上培養(yǎng)的上皮細胞排列更緊密,形態(tài)更小且均一。L-dAM組上皮細胞的克隆形成率明顯比D-dAM組高。示蹤7天的BrdU標記保留細胞在L-dAM組明顯比D-dAM多,而不示蹤的Brd

5、U標記細胞D-dAM稍多,但兩組區(qū)別沒有統(tǒng)計學意義。免疫熒光染色及Western blot均顯示L-dAM組的p63和Ki67表達明顯比D-dAM多,K12在L-dAM組主要在淺層上皮細胞表達,基底層不表達,D-dAM組細胞層較少,全層表達K12,蛋白印跡法結(jié)果顯示D-dAM組K12表達較多;K14切片染色D-dAM組全層表達,L-dAM組表達較弱,但蛋白印跡法顯示K14在L-dAM組比D-dAM組稍多。在L-dAM上培養(yǎng)的上皮擴增后較