PMAP-36的分子改良及其作用機理的研究.pdf

1、PMAP-36是來源于豬骨髓含36個氨基酸的陽離子抗菌肽。本研究以PMAP-36為模板，通過優(yōu)化相關結構參數，如兩親性、結構傾向性等對其進行改良，在此基礎上測定了改良肽PRW4、PRW4-d和PRW4-R的抗菌活性和作用機理;篩選出具有特異性抗綠膿桿菌肽T9W，評估了T9W抗綠膿桿菌效果;基于T9W序列特征，全新設計一系列含有七肽重復序列的抗菌肽，比較了這些肽在抗綠膿桿菌和作用機制方面的差異。主要研究結果如下:
　　(1)非完美兩

2、親性抗菌肽的設計。兩親性是影響抗菌肽活性的重要參數之一。完美兩親性結構通常可以提高抗菌肽的活性，但同時也會引起細胞毒性的增加。通過分析PMAP-36序列及氨基酸組成，采用序列截短和氨基酸替換方法，設計一系列非完美兩親性α-螺旋抗菌肽。首先，截取PMAP-36N端16個氨基酸序列，命名為RI16。與PMAP-36相比，RI16具有完美的兩親性結構。根據α-螺旋蛋白折疊原則，利用色氨酸(Trp)替換兩親性結構極性面中的成對的賴氨酸(Lys)

3、設計了一系列非完美兩親性抗菌肽。結果表明，具有氫鍵連接的Trp改良肽PRW4具有較強的廣譜抗菌活性，其最小抑菌濃度(MIC)在4-8μM之間，同時不具有細胞毒性。PRW4可透化細菌細胞外膜和內膜，引起膜電勢發(fā)生改變，破壞細胞膜完整性。掃描電鏡和透射電鏡觀測結果表明，PRW4引起細胞膜形態(tài)發(fā)生改變，細胞內容物釋放，表明PRW4通過破壞細胞膜發(fā)揮抗菌作用。這些結果表明，適度破壞抗菌肽的兩親性在提高抗菌活性的同時，能夠降低細胞毒性。
　

4、　(2)具有不同螺旋傾向性抗菌肽的設計。為了進一步驗證和研究非完美兩親性抗菌肽的優(yōu)化或設計方法，以PRW4為模板，分別利用具有不同螺旋傾向性的氨基酸半胱氨酸(Cys)、天門冬氨酸(Asp)、異亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)和D-色氨酸(D-Trp)替換PRW4中的Trp。同時，為了研究精氨酸（Arg）的重要作用，將PRW4中的Lys全部替換成Arg。結果表明，與PRW4相比，D-Trp取代的抗菌肽PRW4-d比Cys(C4)、Asp

5、(D4)、Ile(I4)和Pro(P4)取代的抗菌肽活性高。而且，Arg取代抗菌肽PRW4-R的抗菌活性和細胞選擇性進一步提高。優(yōu)化的肽序列PRW4-d和PRW4-R通過引起細胞膜電勢能損失，通透性增加，完整性破壞發(fā)揮抗菌作用。這些結果對設計或優(yōu)化短鏈抗菌肽具有一定的借鑒意義。
　　(3)疏水面完整性對抗菌肽活性的影響。在兩親性結構中，疏水面的完整性對抗菌肽的活性具有重要影響。RI16疏水面的中心位置是一個中性氨基酸蘇氨酸(Thr

6、)，為了研究疏水面完整性對抗菌肽活性的影響，以RI16為模板，分別利用帶正電荷氨基酸Lys(T9K)、疏水性氨基酸Ile(T9I)，以及芳香族氨基酸Trp(T9W)和苯丙氨酸(Phe)(T9F)替換RI16序列中的Thr。結果表明，疏水面的完整性與抗菌肽的抗菌活性之間沒有顯著的相關關系。疏水面中心位置的Trp是抗菌肽T9W發(fā)揮抗綠膿桿菌活性的關鍵。
　　T9W具有較強的抗綠膿桿菌活性，包括臨床和耐藥菌株，其MIC為1-2μM，致死

7、濃度(LC)為1-4μM，表明T9W通過殺菌機制發(fā)揮抗綠膿桿菌活性。殺菌動力學試驗結果表明，T9W在30 min(1×LC)或5min(4×LC)內可快速殺死綠膿桿菌，包括耐藥菌株。而且，T9W與抗生素環(huán)丙沙星和慶大霉素具有協(xié)同效應。細胞毒性試驗結果表明，T9W對紅細胞和巨噬細胞均沒有毒性。細胞選擇性試驗結果進一步表明，T9W能夠有效地清除細胞外的綠膿桿菌，而對細胞本身沒有毒性。此外，T9W還具有較強的鹽離子穩(wěn)定性和抗生物被膜（biof

8、ilm）活性。T9W主要是通過與綠膿桿菌細胞外膜LPS結合，聚集在細胞表面，破壞質膜完整性，引起細胞內容物泄漏，從而達到殺菌目的。這些結果表明T9W具有開發(fā)成抗綠膿桿菌藥物的潛力。
　　(4)七肽重復序列抗菌肽的全新設計。根據T9W的序列特征，利用亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)、Trp、Phe和Arg，全新設計含有七肽重復序列模型的抗菌肽分子，其序列模型為(abcdefg)n-(W)n-(gfedcba)n（a和d分別為Leu

9、、Ala、Trp和Phe，b、c、e、f和g為Arg，W為Trp，n為重復單位）。結果表明，a和d位置為Leu的肽序列具有更強的抗菌活性。七肽重復序列的延長誘導肽鏈形成coiled-coil結構，表現出較強的抗菌活性，而增加七肽重復序列之間的Trp影響肽鏈螺旋結構的形成和細胞選擇性。優(yōu)化的肽序列能夠有效地清除綠膿桿菌biofilm，中和內毒素，以及具有較強的鹽離子穩(wěn)定性。此外，這些肽序列能夠引起細胞膜通透性增加，質膜完整性破壞，從而發(fā)揮

10、抗菌活性。
　　本研究以豬源抗菌肽PMAP-36為模板，通過破壞抗菌肽兩親性的思路設計了一系列的α-螺旋抗菌肽，篩選出的抗菌肽PRW4、PRW4-d和PRW4-R具有廣譜抗菌活性;優(yōu)化的抗菌肽T9W具有特異性抗綠膿桿菌活性;設計的含有七肽重復序列的抗菌肽也具有較強的抗綠膿桿菌活性。初步探明篩選出的改良肽是通過與細胞膜相互作用發(fā)揮抗菌功能的。這些結果為研制新型抗菌藥物提供了優(yōu)良的候選抗菌肽，為有效替代或減少抗生素作為飼料添加劑的使用