淫羊藿苷對鈦顆粒誘導假體周圍骨溶解抑制作用的研究.pdf

1、本文從以下幾部分進行了論述。
　　第一部分 鈦顆粒誘導小鼠顱骨骨溶解模型的建立和評價
　　目的:建立鈦(Ti)顆粒誘導的小鼠顱骨骨溶解模型,模擬磨損顆粒誘導假體無菌性松動的病理過程。
　　方法:7-8周齡健康雄性C57BL/6小鼠20只,隨機分為兩組:(A)對照組;(B)Ti組。Ti組小鼠接受手術(shù)將無菌去內(nèi)毒素的Ti顆粒5毫克植入小鼠顱骨骨面上誘導骨溶解;對照組小鼠接受相同的手術(shù)步驟,但將無菌生理鹽水置于顱骨骨面作為對

2、照。兩周后所有小鼠過量麻醉處死,取顱骨標本做研究使用。以顱骨骨面冠、矢狀縫交點為中心選中直徑為5mm的圓形“感興趣區(qū)域(ROI)”作為研究對象。蘇木精伊紅(H&E)染色法檢測兩組顱骨標本中骨溶解及炎性細胞浸潤情況,Paint.NET軟件測量骨膜厚度,酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測小鼠顱骨ROI區(qū)域體外培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素1β(IL-1β)的含量,實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(QRT-PCR)法檢測TN

3、F-α、IL-1β基因mRNA轉(zhuǎn)錄量。
　　結(jié)果:實驗過程中無動物死亡。顱骨標本大體觀察見局部皮膚組織無紅腫、滲液、皮疹及流膿等;Ti覆蓋顱骨骨面粗糙,凹凸不平。H&E染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),Ti組小鼠顱骨骨面有明顯的蟲蝕樣改變,骨膜內(nèi)可見大量細胞浸潤,炎性細胞居多,成纖維細胞較少。Paint.NET軟件測量結(jié)果表明Ti組小鼠顱骨骨膜增厚為(0.30±0.03)mm,與對照組(0.06±0.01)mm比較,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。

4、ELISA結(jié)果顯示Ti組顱骨培養(yǎng)上清中TNF-α,IL-1β含量分別為(1440.12±82.33)ng/l和(872.13±42.39)ng/l,與對照組(235.01±35.41)ng/l和(140.02±21.07)ng/l比較,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示,經(jīng)Ti刺激后, Ti組顱骨標本中TNF-α,IL-1β基因mRNA含量增多至7.31±0.40和9.62±0.85,與對照組(標準化為1)比較,差異

5、有顯著性意義(p<0.05)。
　　結(jié)論:Ti顆粒誘導的小鼠顱骨骨溶解模型簡單、可重復強,能較為準確的模擬關(guān)節(jié)假體無菌性松動的病理過程。
　　第二部分 淫羊藿苷對鈦顆粒誘導骨溶解的影響
　　目的:探討淫羊藿苷(IC)對Ti顆粒誘導小鼠顱骨骨溶解的治療作用及其機制。
　　方法:7-8周齡健康雄性C57BL/6小鼠80只,隨機分為四組:(A)對照組,(B)IC組,(C)Ti+安慰劑組,(D)Ti+IC組。C和D組Ti

6、顆粒植入小鼠顱骨上建立骨溶解模型,A及B組小鼠僅接受相同的手術(shù)步驟,無Ti顆粒植入。建模當天B組和D組小鼠以IC(200毫克/千克/天)灌胃給藥,A和C組以相同劑量安慰劑(PBS)治療,兩周后所有小鼠過量麻醉處死,取顱骨備用。利用micro-ct掃描不同處理組ROI區(qū)域,根據(jù)三維重建圖像觀察各組小鼠顱骨表面溶骨餡窩數(shù)量,CT自帶軟件定量計算顱骨標本ROI區(qū)域骨量(BV),骨礦化密度(BMD),骨表面積(BS),骨表面積/骨量比率(BS/

7、BV);H&E染色法檢測骨溶解及炎性細胞浸潤情況,Paint.NET軟件測量骨膜厚度;TRAP染色檢測成熟破骨細胞;免疫組織化學染色檢測RANKL和RANK的表達變化;ELISA檢測顱骨培養(yǎng)上清中TNF-α,IL-1β的含量;QRT-PCR檢測RANKL、 RANK、TNF-α和IL-1β基因mRNA表達變化。
　　結(jié)果:
　　1. Micro-CT三維重建圖像顯示對照組未放置Ti顆粒的小鼠顱骨表面光滑,未見明顯的骨溶解跡象

8、,而Ti+安慰劑組小鼠顱骨骨面蝕骨現(xiàn)象明顯,骨溶解陷窩密布;相較于Ti+安慰劑組,Ti+IC組小鼠經(jīng)IC口服治療后溶骨現(xiàn)象得到遏制,蝕骨陷窩數(shù)量明顯減少。
　　Micro-CT3D分析定量檢測:對照組中BV,BMD,BS,BS/BV值分別為(3.79±0.23)mm3,(0.71±0.05)mg/mm2,(35.71±1.98)mm2,(9.41±1.06)1/mm。Ti+安慰劑組中 BV,BMD值降至(2.03±0.12)mm3

9、,(0.58±0.03)mg/mm2,BS, BS/BV值增高至(45.73±3.84)mm2,(22.50±2.31)1/mm,與對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);經(jīng)IC口服干預(yù)后,Ti+IC組中BV,BMD值增至(3.51±0.23)mm3,(0.69±0.04)mg/mm2,BS,BS/BV值降至(37.21±1.98)mm2,(10.57±1.29)1/mm,與Ti+安慰劑組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。<

10、br>　　2.H&E染色:對照組骨膜內(nèi)細胞總量較少,成纖維細胞居多,炎性細胞較少,骨膜較薄;Ti+安慰劑組骨膜內(nèi)可見大量細胞浸潤,炎性細胞居多,成纖維細胞較少。Paint.NET軟件測量結(jié)果表明對照組、IC組、Ti+安慰劑組、Ti+IC組顱骨骨膜厚度分別為(0.07±0.01)mm,(0.06±0.01)mm,(0.28±0.04)mm,(0.12±0.02)mm。Ti+安慰劑組與對照組相比差異有顯著性意義(P<0.05);Ti+IC組

11、與Ti+安慰劑組相比差異有顯著性意義(P<0.05)。
　　3. TRAP染色結(jié)果顯示,Ti+安慰劑組可見多個細胞胞漿呈紫紅色、細胞核3個以上的TRAP陽性細胞,對照組和IC組陽性深染多核細胞較少;各組多核細胞計數(shù)顯示:對照組(5.0±1.3)個,IC組未檢出,Ti+安慰劑組(36.0±4.8)個,Ti+IC組(11.0±2.3)個, Ti+安慰劑組與對照組, Ti+IC組與Ti+安慰劑組相比較,差異有顯著性意義(P<0.05)。

12、IC顯著減少Ti顆粒誘導的TRAP陽性細胞形成。
　　4. ELISA檢測結(jié)果顯示:對照組上清中TNF-α和 IL-1β蛋白濃度分別為(237.13±37.36)ng/l和(133.09±19.64)ng/l;Ti+安慰劑組中,二者濃度增長至(1447.52±78.23)ng/l和(889.14±45.94)ng/l,與對照組相比,差異有顯著性意義(P<0.05);Ti+IC組TNF-α和 IL-1β濃度下降至(568.86±42

13、.32)ng/l和(279.39±19.44)ng/l,與Ti+安慰劑組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　5.免疫組化染色顯示:相較于對照組,Ti+安慰劑組中RANKL、RANK陽性深染位點分布密集,區(qū)域廣泛,Ti+IC組中陽性深染位點分布稀疏,區(qū)域狹窄。這表明鈦顆粒誘導RANKL、RANK蛋白表達上調(diào),IC通過減少RANKL、RANK表達量抑制骨溶解。
　　6.實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(QRT-PCR)分析

14、顯示:設(shè)定對照組TNF-α和IL-1βmRNA表達量為1,IC組中二者表達量分別為0.81±0.13,0.83±0.12; Ti+安慰劑組為7.60±0.60;9.80±0.94;Ti+IC組為2.40±0.18;2.10±0.23;與對照組相比,Ti+安慰劑組中TNF-α和IL-1βmRNA表達量上調(diào)明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);經(jīng)IC治療后,Ti+IC組TNF-α和IL-1β基因轉(zhuǎn)錄量下調(diào)顯著,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.0

15、5)。這表明,淫羊藿苷對鈦顆粒誘導骨溶解的抑制作用涉及TNF-α和IL-1β基因下調(diào)。
　　Ti+安慰劑組中RANKL和RANK轉(zhuǎn)錄量分別為9.02±1.05,11.01±0.97,與對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。RANKL和RANK mRNA轉(zhuǎn)錄量在Ti顆粒刺激下明顯上調(diào)。相反的,Ti+IC組中IC干預(yù)治療后RANKL和RANK基因表達量顯著減少為2.50±0.36,3.03±0.31,與Ti+安慰劑組相比,差異