Glypican3相關(guān)miRNAs在人肝細(xì)胞癌變過程中的作用機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）起病隱匿，進(jìn)展快，死亡率高，因此早期診斷對(duì)于提高患者的存活率至關(guān)重要。從病理學(xué)角度講，HCC的發(fā)生是一個(gè)多階段、多步驟逐步演變和積累的過程，其中一個(gè)最主要的過程就是從癌前病變進(jìn)展為HCC。目前已經(jīng)提出的癌前病變有：異型增生病灶（dysplastic foci，DF）、變異肝細(xì)胞結(jié)節(jié)（nodules of altered hepatocyte，NAH

2、）和異型增生結(jié)節(jié)（dysplastic nodules，DN）。這些癌前病變大多數(shù)都存在于肝硬化組織中。研究表明，很多高頻出現(xiàn)于肝硬化、癌前病變以及小肝癌中的分子變異都可能是HCC的早期分子事件，對(duì)于這些早期分子變異的研究將有助于HCC的早期診斷并制定新的治療策略。
　　微小RNA（microRNA）（以下簡稱miRNA）是一類長約17-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA分子，在腫瘤發(fā)生不同階段的水平存在顯著差異。它的突變和異常表

3、達(dá)與各種腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，并且通過與靶信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3’-非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）不完全配對(duì)結(jié)合調(diào)控其靶基因的表達(dá)，從而發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用，與細(xì)胞的癌變也有著極為密切的關(guān)系。此外，miRNAs能夠抵抗內(nèi)源性RNA酶的降解從而在血漿中穩(wěn)定存在，方便檢測，且對(duì)患者無創(chuàng)傷性。因此 miRNAs可能成為一種新的腫瘤標(biāo)志物和治療干預(yù)的靶點(diǎn)。關(guān)于miRNAs與HCC的研

4、究，文獻(xiàn)中報(bào)道比較多，并且篩選出了一些與HCC發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后等相關(guān)的、具有重要意義的miRNAs。然而關(guān)于小肝癌、癌前病變以及癌前病變進(jìn)展為HCC相關(guān)的miRNAs表達(dá)變化，文獻(xiàn)報(bào)道卻頗為少見，而且僅限于動(dòng)物模型。
　　根據(jù)文獻(xiàn)中已有的HCC miRNAs表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)篩選和查閱相關(guān)文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)miR-202、miR-1271-5p、miR-1271-3p和miR-204在HCC中表達(dá)水平下調(diào)，但在HCC中的表達(dá)變化及

5、功能卻未進(jìn)一步深入研究。miR-211是miR-204的同源miRNA，在其他一些惡性腫瘤中呈低表達(dá)，在HCC中的研究卻未見報(bào)道。此外，miRNAs是通過調(diào)控其下游的靶基因而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能，尋找并鑒定 miRNAs調(diào)控的靶基因才可能闡明 miRNAs的作用機(jī)制。所以我們利用生物信息學(xué)方法及相關(guān)軟件進(jìn)行搜索和比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個(gè)這五個(gè) miRNAs可能共同調(diào)控的靶基因磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican3，GPC3）。GPC3屬于

6、硫酸乙酰肝素糖蛋白家族，通過磷脂酰肌醇錨定在細(xì)胞膜表面，在細(xì)胞的生長發(fā)育和惡變過程中起到關(guān)鍵作用，是近年來研究的一個(gè)熱點(diǎn)基因。有研究顯示，GPC3及其mRNA在HCC組織中高表達(dá)，并可能通過經(jīng)典Wnt信號(hào)通路發(fā)揮作用。而且，在HCC患者的血清中也可檢測到GPC3，而在正常肝組織未檢測到。因此認(rèn)為其可作為一種新的非常有前景的HCC早期診斷的標(biāo)志物。另外，有研究顯示，GPC3在一些癌前病變中也有不同程度表達(dá)，提示其具有某種預(yù)警價(jià)值。肝硬化或

7、DN惡性轉(zhuǎn)化為HCC其特點(diǎn)為GPC3的表達(dá)明顯增強(qiáng)，肝硬化組織中的小灶性病變?nèi)绯霈F(xiàn)GPC3陽性則強(qiáng)烈提示為HCC，而不管陽性細(xì)胞的百分比。而且，我們之前的 Affymetrix單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）6.0芯片結(jié)果也顯示，GPC3在HCC中呈擴(kuò)增狀態(tài)。以上這些觀點(diǎn)使我們從中受到啟發(fā)，HCC中miR-202、miR-1271-5p、miR-1271-3p、miR-204低表達(dá)和

8、miR-211可能低表達(dá)與它們可能共同的靶基因 GPC3高表達(dá)這一現(xiàn)象以及GPC3通過Wnt信號(hào)通路促進(jìn)HCC發(fā)生這一機(jī)制，提示這5個(gè) miRNAs與GPC3之間可能存在著某種聯(lián)系，進(jìn)一步探討它們?cè)贖CC及其癌前病變中的表達(dá)以及與GPC3的靶向關(guān)系，闡明它們?cè)诟渭?xì)胞癌變過程中的作用機(jī)制，并找到用來干預(yù)的分子信號(hào)通路，可能更有助于HCC的監(jiān)測、早期診斷和早期治療。
　　目的：
　　1.檢測5個(gè)miRNAs，即miR-202、m

9、iR-1271-5p、miR-1271-3p、miR-204和miR-211在肝癌細(xì)胞系和進(jìn)展期HCC組織中的表達(dá)以及miR-202和miR-211對(duì)肝癌細(xì)胞生物性狀的影響，進(jìn)一步證實(shí)它們抑癌基因的作用；
　　2.通過免疫組化法、克隆性分析及染色體雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）分析篩選出GPC3陽性且伴有分子畸變的DN（以下簡稱GPC3陽性DN），然后觀察GPC3在GPC3陽性DN、小HCC和進(jìn)

10、展期HCC中的表達(dá)變化，證實(shí)GPC3在肝細(xì)胞癌變過程中發(fā)揮重要作用；
　　3.檢測miR-202和miR-211在GPC3陽性DN、小HCC和進(jìn)展期HCC中的表達(dá)變化，闡明它們?cè)诟渭?xì)胞癌變過程中扮演的角色；
　　4.證實(shí)miR-202和GPC3的負(fù)性轉(zhuǎn)錄后調(diào)控關(guān)系，闡明miR-202在HCC中可能的作用機(jī)制，為今后利用這些潛在的分子標(biāo)志物進(jìn)行HCC的監(jiān)測、早期診斷以及選擇合適的靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)和治療提供新的理論依據(jù)。
　　

11、方法：
　　1.利用實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)（real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）法檢測5個(gè)miRNAs在人肝癌細(xì)胞系和進(jìn)展期HCC組織中的表達(dá)水平：1）檢測5個(gè)miRNAs在人肝癌細(xì)胞系hepG2、Huh7和人正常肝細(xì)胞系HL-7702中的表達(dá)水平；2）檢測5個(gè)miRNAs在56例配對(duì)進(jìn)展期HCC組織及相應(yīng)非腫瘤肝組織中的表達(dá)水平；
　　2.通過

12、體外實(shí)驗(yàn)觀察miR-202和miR-211對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討miR-202對(duì)肝癌細(xì)胞裸鼠致瘤的影響：1）根據(jù)56例配對(duì)進(jìn)展期HCC的RT-qPCR檢測結(jié)果，選擇出相比非腫瘤肝組織在進(jìn)展期HCC中有顯著下調(diào)，且平均差異倍數(shù)下調(diào)2倍以上的 miR-202和miR-211分別進(jìn)行過表達(dá)，即將人工合成的miR-202 mimic和miR-211 mimic分別轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞系，觀察它們對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖[3-（4，5

13、-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT法）、遷移（Transwell實(shí)驗(yàn)）、侵襲（Matrigel實(shí)驗(yàn)）以及細(xì)胞周期和凋亡（流式細(xì)胞術(shù)）的影響；2）裸鼠腋部皮下成瘤兩周后，開始瘤內(nèi)點(diǎn)狀注射micrONTMagomir-202及其陰性對(duì)照（negative control,NC），每三天注射一次

14、，同時(shí)測量腫瘤體積，共持續(xù)兩周，以觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞裸鼠致瘤的影響。
　　3.檢測可能的靶基因GPC3在肝癌細(xì)胞系、進(jìn)展期HCC、小HCC及DN中的表達(dá)情況：1）免疫組化法觀察GPC3在HCC及DN中的表達(dá)，克隆性分析技術(shù)及染色體LOH檢測進(jìn)一步篩選出GPC3陽性DN：①利用MaxVision免疫組織化學(xué)染色方法檢測GPC3在136例HCC和103個(gè)DN中的表達(dá)情況，觀察GPC3蛋白表達(dá)水平與HCC患者臨床病理特征參數(shù)的關(guān)系；②利用

15、X染色體失活的嵌合性及雄激素受體（androgen receptor，AR）基因多態(tài)性的克隆性分析技術(shù)檢測來自于女性81個(gè)DN的克隆性；③利用微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)及PCR技術(shù)檢測103個(gè)DN在D8S262、D11S1301和D6S1008等11個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)的染色體LOH發(fā)生情況，然后挑選出女性患者中單克隆增生且GPC3陽性DN和男性患者中具有高頻率染色體LOH的GPC3陽性DN；2）利用RT-qPCR法檢測GPC3 mRNA在肝癌細(xì)胞

16、系、進(jìn)展期HCC、小HCC和GPC3陽性DN中的表達(dá)情況及變化；
　　4. RT-qPCR法檢測miR-202和miR-211在10例小HCC和8例GPC3陽性DN中的表達(dá)水平，并與之前它們?cè)谶M(jìn)展期HCC中的表達(dá)水平相比較，篩選出可能參與肝細(xì)胞癌變的miR-202；
　　5. miR-202與GPC3靶向關(guān)系的研究：1）轉(zhuǎn)染miR-202 mimic到肝癌細(xì)胞系Huh7，培養(yǎng)48小時(shí)后，分別利用RT-qPCR和Western

17、 blotting檢測GPC3 mRNA水平和蛋白表達(dá)情況；2）雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-202與GPC3之間的負(fù)性調(diào)控關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1. GPC3相關(guān)5個(gè)miRNAs在肝癌細(xì)胞系和進(jìn)展期HCC組織中的表達(dá)水平均顯著下調(diào)：1）與正常肝細(xì)胞系HL-7702相比，miR-202、miR-1271-5p、miR-1271-3p、miR-204和miR-211在肝癌細(xì)胞系hepG2和Huh7中的表達(dá)水平均顯著下調(diào)，其中

18、，在Huh7比hepG2中下調(diào)更明顯；2）相比非腫瘤肝組織，miR-202（P=0.002）、miR-1271-5p（P=0.002）、miR-1271-3p（P=0.018）、miR-204（P=0.029）和miR-211（P=0.000）在進(jìn)展期HCC組織中表達(dá)水平均顯著下調(diào)。其中，miR-202和miR-211表達(dá)水平下調(diào)平均差異倍數(shù)在2倍以上，但二者表達(dá)水平與HCC患者臨床病理特征參數(shù)均不具有相關(guān)性；
　　2.細(xì)胞功能實(shí)

19、驗(yàn)顯示過表達(dá)miR-202和miR-211后，肝癌細(xì)胞的增殖能力，集落形成能力、侵襲和遷移能力均明顯減弱，但對(duì)細(xì)胞周期影響不明顯。miR-202過表達(dá)后促進(jìn)細(xì)胞凋亡，miR-211則對(duì)細(xì)胞凋亡影響不明顯；體內(nèi)試驗(yàn)顯示裸鼠成瘤后每三天瘤內(nèi)注射micrONTMagomir-202，相比對(duì)照組，腫瘤生長速度明顯變慢，體積較小。3. GPC3在肝癌細(xì)胞系、進(jìn)展期HCC、小HCC和DN中的表達(dá)水平均顯著上調(diào)：1） MaxVision免疫組織化學(xué)法

20、檢測結(jié)果表明，136例HCC中，103例表達(dá)GPC3（75.7％，103/136），且陽性率與乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽性相關(guān)（P=0.000）；103個(gè)DN中，19例表達(dá)GPC3，陽性率為18.4%（19/103），其中包括16個(gè)高級(jí)別異型增生結(jié)節(jié)（high-grade dysplastic nodules，HGDN）和3個(gè)低級(jí)別異型增生結(jié)節(jié)（low-grade dyspl

21、astic nodules，LGDN）；克隆性分析檢測結(jié)果表明，來自于女性的15個(gè)GPC3陽性DN和28個(gè)GPC3陰性DN均是單克隆增生，即為腫瘤性增生；染色體LOH檢測則表明，GPC3陽性DN相比其陰性DN，HGDN相比LGDN，染色體 LOH發(fā)生頻率均偏高。并根據(jù)以上三個(gè)步驟篩選出了19個(gè)GPC3陽性 DN作為進(jìn)一步研究對(duì)象；2）GPC3 mRNA在HepG2和Huh7中的表達(dá)水平相比正常肝細(xì)胞系 HL-7702均顯著上調(diào)，其中在H

22、epG2中的表達(dá)水平上調(diào)更顯著；3）GPC3 mRNA在GPC3陽性DN、小HCC和進(jìn)展期HCC中的表達(dá)水平依次上調(diào)，其中在小HCC中的相對(duì)表達(dá)水平較GPC3陽性DN差異顯著（P=0.003），而與進(jìn)展期HCC比較無顯著差異（P=0.145）；
　　4. miR-202和miR-211在小HCC和GPC3陽性DN中的相對(duì)表達(dá)水平均顯著下調(diào)。與之前它們?cè)谶M(jìn)展期HCC中的表達(dá)水平相比較，miR-202在GPC3陽性DN、小HCC和進(jìn)展

23、期HCC中的表達(dá)水平依次下調(diào)，且在GPC3陽性DN和小HCC中的表達(dá)水平具有顯著差異（P=0.038），而小 HCC與進(jìn)展期 HCC之間表達(dá)水平無顯著差異（P=0.432）。miR-211在三者之間的表達(dá)水平則均無明顯差異；
　　5. miR-202與GPC3具有直接靶向負(fù)性轉(zhuǎn)錄后調(diào)控關(guān)系：1）在Huh7細(xì)胞中過表達(dá)miR-202后，GPC3 mRNA及其蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)；2）雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果表明，分別共轉(zhuǎn)染miR

24、-202mimic（或miR-202mimic NC）和野生型或突變型GPC3-pmiR-RB-REPORTTM Vector后，野生型表達(dá)質(zhì)粒其螢光素酶活性明顯降低，而對(duì)含突變位點(diǎn)的miR-202表達(dá)質(zhì)粒其螢光素酶活性無明顯改變。
　　結(jié)論：
　　1. GPC3相關(guān)miRNAs，即miR-202、miR-1271-5p、miR-1271-3p、miR-204和miR-211在HCC中的表達(dá)水平均顯著下調(diào)，其中miR-202

25、在GPC3陽性DN、小HCC和進(jìn)展期HCC中的相對(duì)表達(dá)水平依次下調(diào)，且在GPC3陽性DN和小HCC中的表達(dá)水平具有顯著差異，提示可能與肝細(xì)胞癌變有關(guān)，是HCC發(fā)生的早期分子事件，可作為HCC監(jiān)測和早期診斷的潛在分子標(biāo)志物。miR-211在HCC中呈低表達(dá)為首次發(fā)現(xiàn)。2.細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)miR-202和miR-211后，肝癌細(xì)胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲能力均明顯減弱，而對(duì)細(xì)胞周期無明顯影響。miR-202過表達(dá)后促進(jìn)細(xì)胞凋亡，

26、miR-211過表達(dá)后則對(duì)細(xì)胞凋亡影響不明顯。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則表明，micrONTMagomir-202可顯著抑制HCC的生長。以上這些結(jié)果均提示二者發(fā)揮抑癌基因的作用。
　　3. GPC3在GPC3陽性DN，小HCC和進(jìn)展期HCC中的表達(dá)水平依次上調(diào)，其中在小HCC中的相對(duì)表達(dá)水平較GPC3陽性DN差異顯著，而與進(jìn)展期HCC無顯著差異，提示GPC3在肝細(xì)胞癌變過程中同樣發(fā)揮重要作用；
　　4. miR-202與GPC3具有直接負(fù)