雞肉中彎曲菌的定量流行病學(xué)分析及其有機(jī)酸控制技術(shù)研究.pdf

1、彎曲菌是繼沙門菌、志賀菌之后影響動物源性食品安全的又一個重要的人獸共患病原菌，不僅可導(dǎo)致人類胃腸炎和食物中毒，而且是人類格林-巴利綜合征的重要前驅(qū)因子。該菌廣泛存在于家禽腸道，尤其以雞腸道定植最甚，并通過污染雞肉導(dǎo)致人類感染。
　　充分認(rèn)知彎曲菌對動物源性食品安全的影響，并及時采取科學(xué)的控制措施，是防止該彎曲菌危害人類健康的關(guān)鍵途徑。歐美等發(fā)達(dá)國家擁有相對完善的致病菌定量風(fēng)險評估體系，包括彎曲菌對零售雞肉的污染狀況，大量研究數(shù)據(jù)可

2、以增強(qiáng)對彎曲菌病爆發(fā)的預(yù)警能力。而發(fā)展中國家包括中國的定量風(fēng)險評估數(shù)據(jù)則相對匱乏，這一現(xiàn)狀嚴(yán)重制約了家禽生產(chǎn)及處理階段的防控措施的發(fā)展。
　　本研究對揚(yáng)州市區(qū)零售雞肉中的彎曲菌進(jìn)行了為期一年的定量流行病學(xué)研究，并運(yùn)用Box-Behnken Design的設(shè)計開展三因素三水平的響應(yīng)面試驗，優(yōu)化有機(jī)酸對雞肉表面彎曲菌的抑制條件，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了空腸彎曲菌的flgS突變株，比較突變株與野生株之間的酸耐受能力差異，為研究空腸彎曲菌的酸耐受

3、機(jī)制及其調(diào)控因子提供試驗數(shù)據(jù)，為建立雞肉中彎曲菌的高效減菌技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。
　　一、零售雞肉中彎曲菌的定量流行病學(xué)研究
　　2012年至2013年間，選取江蘇省揚(yáng)州市區(qū)3個超市和3個農(nóng)貿(mào)市場，每月采集20份樣品，使用平板計數(shù)結(jié)合分子生物學(xué)鑒定的方法，分別對其零售整雞中的彎曲菌進(jìn)行檢測，并定量分析彎曲菌污染水平，連續(xù)監(jiān)測12個月。
　　檢測結(jié)果表明，240份整雞樣品的彎曲菌陽性率為51.3％，陽性樣品的平均帶菌量為14

4、73.49 CFU/g。123份陽性樣品中，78.86％的樣品帶菌量超過20CFU/g。其中，超市樣品的陽性率為35.8％，陽性樣品的平均帶菌量為152.3CFU/g;農(nóng)貿(mào)市場樣品的陽性率為66.7％，陽性樣品的平均帶菌量為2183.6CFU/g，農(nóng)貿(mào)市場零售整雞樣品的彎曲菌污染情況明顯更為嚴(yán)重。兩種銷售方式下，整雞中彎曲菌污染水平隨季節(jié)變化的趨勢均很明顯，隨著夏季氣溫升高，樣品的陽性率及陽性樣品的平均帶菌量均穩(wěn)步上升，而冬季則大幅下降

5、?？漳c彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的分離率最高，分別為45.5％和30.9％。定性及定量結(jié)果顯示，揚(yáng)州市區(qū)的零售整雞中彎曲菌污染比較嚴(yán)重，控制零售環(huán)節(jié)中的整雞彎曲菌帶菌量迫在眉睫。
　　二、有機(jī)酸對雞肉表面彎曲菌的抑制方法建立及應(yīng)用
　　從《GB2760-2011食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》允許添加的有機(jī)酸中篩選出對彎曲菌抑菌性最強(qiáng)的乳酸。運(yùn)用控制變量法，根據(jù)乳酸對空腸彎曲菌NCTC11168菌株的抑制率，對影響乳酸抑菌效果的

6、3個單因素（濃度、時間、溫度）分別進(jìn)行實驗，獲得3個單因素的最佳抑菌區(qū)間。根據(jù)Box-Behnken Design的中心組合實驗設(shè)計，以濃度、時間和溫度3個因素為自變量，以抑菌率和肌苷酸含量作為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法在三因素三水平上對處理條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最大抑菌率和肌苷酸含量。建立了低濃度長時間處理模式及高濃度短時間處理模式，對最優(yōu)條件進(jìn)行驗證，并將其應(yīng)用于肉雞屠宰加工生產(chǎn)線。
　　結(jié)果表明，根據(jù)試驗結(jié)果和回歸方程，利用軟件

7、獲得了低濃度長時間處理模式的最佳組合條件，即乳酸濃度0.19％，處理時間17min，處理溫度20.9℃。在該條件下，抑菌率的預(yù)測值為98.62％，肌苷酸含量的預(yù)測值為1.8678mg/g。高濃度短時間處理模式的最佳組合條件為乳酸濃度0.82％，處理時間6.86s，處理溫度7.97℃。在該條件下，抑菌率的預(yù)測值為98.81％，肌苷酸含量的預(yù)測值為1.8775mg/g。雞肉模擬驗證實驗與理論預(yù)測值的誤差在±1％以內(nèi)，說明實驗條件的參數(shù)準(zhǔn)確可

8、靠，按照建立的模型在實踐中進(jìn)行預(yù)測是可行的。將其應(yīng)用于屠宰生產(chǎn)線上后，不會顯著降低雞肉中彎曲菌的陽性率，與傳統(tǒng)次氯酸鈉消毒的效果沒有顯著差異。單獨使用本研究建立的兩種抑菌模式對雞肉進(jìn)行處理，彎曲菌載量以及菌落總數(shù)之間沒有顯著差異，降低細(xì)菌載量的效果不及傳統(tǒng)方法，但是二者結(jié)合的減菌效果則與對照組沒有顯著差異。
　　三、空腸彎曲菌flgS突變株的構(gòu)建及其在酸耐受中的作用分析
　　根據(jù)GenBank上的空腸彎曲菌NCTC11168

9、全基因組序列，以及質(zhì)粒pRY107圖譜設(shè)計引物，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增flgS基因以及卡那霉素抗性基因盒;將目的基因連接于克隆載體pMD-19T，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，酶切鑒定;測序正確后，通過酶切連接反應(yīng)將載體中的卡那霉素抗性基因盒插入flgS基因內(nèi)部構(gòu)建自殺載體pMD19T-flgS-kanr;將自殺載體電轉(zhuǎn)化NCTC11168感受態(tài)細(xì)胞，同源重組篩選flgS突變株。
　　分別對野生株和突變株的酸耐受能力進(jìn)行了研究，在低濃度長

10、時間酸脅迫和高濃度短時間酸脅迫中，突變株的抵抗力都明顯低于野生株，而二者在中性生長環(huán)境中的生長情況無明顯差異，表明flgS基因在空腸彎曲菌的酸耐受中扮演著非常重要的作用。鑒于flgS基因為調(diào)控基因，本研究應(yīng)用熒光定量PCR方法對該基因在轉(zhuǎn)錄水平對其他脅迫相關(guān)基因的調(diào)控作用進(jìn)行了研究。flgS基因失活后，在酸環(huán)境中，大部分脅迫相關(guān)基因都會出現(xiàn)上調(diào)，表明flgS基因失活會對其他脅迫基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)造成影響。且flgS在不同酸應(yīng)激中對其他脅迫基因