致病性壞死梭桿菌120ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因的克隆及其特性分析.pdf

1、壞死梭桿菌（Fusobacterium necrophorum）是一種嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陰性桿菌，具有多形性，常引起人的急性咽炎綜合征(Lemierre's Syndrome)和牛、羊、鹿等動(dòng)物的腐蹄病、肝膿腫、壞死性皮炎、犢牛白喉。目前還沒有商品化的壞死梭桿菌疫苗，國(guó)內(nèi)外主要使用抗生素來治療該病，但是抗生素帶來的負(fù)面影響越來越受到人們重視，為了研究120ku血凝素相關(guān)外膜蛋白的生物學(xué)特性，并揭示其作為基因工程亞單位疫苗預(yù)防壞死桿菌病的可

2、行性，本研究根據(jù)已報(bào)道的F.necrophorum120ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因部分核苷酸序列，克隆出該基因完整的核苷酸序列，生物信息學(xué)分析了該蛋白的分子特征，參考抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果，將F.necrophorum120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因的開放閱讀框(Open reading frame)分為3個(gè)彼此重疊的基因片段p1、P2、p3，進(jìn)行原核表達(dá)，純化的重組蛋白P1、P2、P3分別免疫實(shí)驗(yàn)兔，檢測(cè)兔血清中特異性抗體水平，主要研究?jī)?nèi)

3、容如下:
　　1.根據(jù)已報(bào)道的F.necrophorum120ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因部分核苷酸序列(登錄號(hào):AF529887.1)，采用染色體步移技術(shù)，克隆出該基因完整的核苷酸序列并用高保真酶進(jìn)行驗(yàn)證，全長(zhǎng)4247bp，含有一個(gè)3372 bp的ORF，編碼1123個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量約為120ku。生物信息學(xué)分析表明，該蛋白可能是具有血凝活性的外膜自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，并具有較強(qiáng)的抗原性。
　　2.F.necroph

4、orum120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白的原核表達(dá)及純化。參考抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果，將F.necrophorum120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因的ORF分為3個(gè)彼此重疊60 bp左右的基因片段p1、p2、p3，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3，在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用AKTA purifier蛋白純化系統(tǒng)獲得48 ku、59 ku、62 ku的重組蛋白P1、P2、P3，Western b

5、lot分析顯示，純化后的重組蛋白P1、P2、P3具有良好的反應(yīng)原性。
　　3.將純化的重組蛋白P1、P2、P3分別免疫實(shí)驗(yàn)兔，檢測(cè)兔血清中的特異性抗體，結(jié)果顯示，兔血清中的抗體效價(jià)分別為1∶32、1∶16、1∶16，表明重組蛋白均可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)兔產(chǎn)生特異性抗體，具有良好的免疫原性。
　　綜上所述，F(xiàn).necrophorum120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因的克隆及其免疫原性的初步分析，為進(jìn)一步了解120ku血凝素相關(guān)外膜蛋白的生