基于新型MyD88信號通路抑制劑探索GVHD靶向防治新策略及其機(jī)理.pdf

1、第一部分 MyD88信號過表達(dá)與急性GVHD疾病進(jìn)展的相關(guān)性
　　【目的】探討TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在小鼠異基因骨髓移植后急性移植物抗宿主病(GVHD)中的表達(dá)及意義。
　　【方法】以雄性C57BL/6(H-2Kb)小鼠和雌性BALB/c(H-2Kd)小鼠作為骨髓移植的供受者，術(shù)前受者接受致死劑量(8.0Gy)的全身照射處理，4~6小時(shí)內(nèi)輸注供者來源的骨髓細(xì)胞(1*107)和不同數(shù)量的脾臟淋巴細(xì)胞(1*10

2、7，n=12或2*107，n=12)建立不同嚴(yán)重程度的小鼠急性GVHD模型，未接受任何處理的正常BALB/c小鼠作為空白對照(n=6)。以GVHD臨床評分，生存期，靶器官病理作為GVHD的評價(jià)指標(biāo)；分別采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，免疫組化和western blot法檢測 GVHD模型小鼠小腸組織中 TLR4、MyD88和NF-κBp65的表達(dá)；并統(tǒng)計(jì)其基因表達(dá)譜的改變與GVHD進(jìn)展的相關(guān)性。
　　【結(jié)果】急性GVHD的病情進(jìn)展依賴于

3、異基因脾臟淋巴細(xì)胞的輸注數(shù)量，隨GVHD的病情惡化，小腸組織中 TLR4、MyD88與 NF-κBp65的表達(dá)均呈上升趨勢。重度GVHD小鼠病變腸組織TLR4，NF-κBp65 mRNA水平較正常對照顯著升高(P<0.05)。組織中蛋白表達(dá)也有相同的趨勢。此外，TLR4、MyD88和NF-κB mRNA間的表達(dá)不僅呈正相關(guān)，而且其與GVHD的臨床評分也呈正相關(guān)(R=0.814，P<0.001；R=0.828，P<0.001；R=0.56

4、8，P=0.034)。
　　【結(jié)論】GVHD小鼠靶器官組織中TLR4/MyD88/NF-κB信號通路呈明顯的活化狀態(tài)，基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯均有增強(qiáng)，且與 GVHD病情呈顯著的正相關(guān)，可作為藥物研發(fā)的新靶點(diǎn)。
　　第二部分新型MyD88抑制劑TJ-5緩解急性GVHD及機(jī)制
　　【目的】探討 MyD88抑制劑 TJ-M2010-5(TJ-5)對在小鼠異基因骨髓移植后急性GVHD的抑制作用及機(jī)制，基于天然免疫為GVHD的藥物治

5、療提供新思路。
　　【方法】(1)免疫共沉淀檢測TJ-5對MyD88同源二聚化的影響；流式細(xì)胞術(shù)及ELISA檢測TJ-5對DC成熟活化的影響；蛋白質(zhì)印跡檢測TJ-5對DC內(nèi)MyD88信號通路關(guān)鍵分子的表達(dá)影響；淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)檢測TJ-5對異基因T淋巴細(xì)胞增殖的作用。(2)建立C57BL/6(H-2Kb)→BALB/c(H-2Kd)的小鼠骨髓移植后急性GVHD模型。實(shí)驗(yàn)分為四組：GVHD空白對照組，TJ-5治療組，CD40L單抗(

6、MR1)治療組，聯(lián)合治療組。術(shù)后以 GVHD臨床評分，生存期，靶器官病理，炎性因子水平，組織壞死與修復(fù)，嵌合體形成及特異性耐受的形成作為藥物療效的評價(jià)指標(biāo)，比較兩藥單獨(dú)用藥的差異及聯(lián)合用藥治療GVHD的效果。
　　【結(jié)果】 TJ-5能夠劑量依賴性的抑制MyD88分子的同源二聚化和LPS刺激引起的DC成熟，減少其上清液中炎性因子IL-1α，IL-10，IL-12和IL-18分泌；隨TJ-5劑量增加，DC表面TLR4的表達(dá)逐漸升高，而

7、下游分子IRAK4，NF-Bp65的表達(dá)卻明顯降低；TJ-5能減少DC/T混培體系中CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖。移植后觀察60天，TJ-5與MR1組生存期，GVHD臨床評分均顯著優(yōu)于對照組(P<0.05)；聯(lián)合用藥效果更佳，60天生存率達(dá)100％，明顯高于MR1組(70%)，TJ-5組(57%)和對照組(0%)；對照組小鼠肝臟，小腸，皮膚組織Thomas GVHD病理分級Ⅲ~Ⅳ級，其余三組靶器官病變較輕，呈Ⅰ~Ⅱ級改變。TJ-

8、5治療可加速異基因嵌合體的形成，明顯改善GVHD小鼠血循環(huán)中炎性因子，減少靶器官細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)組織修復(fù)。
　　【結(jié)論】新型MyD88抑制劑TJ-5可緩解小鼠骨髓移植后GVHD的進(jìn)展，天然免疫與獲得性免疫系統(tǒng)同時(shí)抑制策略可取得更好的抗GVHD效果，具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　第三部分 TJ-5對荷骨髓瘤小鼠骨髓移植后GVT的影響
　　【目的】探討MyD88抑制劑TJ-M2010-5(TJ-5)在抗GVHD的同時(shí)能否保留G

9、VT效應(yīng)，為TJ-5的臨床應(yīng)用提供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　【方法】建立C57BL/6(H-2Kb)→BALB/c(H-2Kd)的GVHD荷骨髓瘤(SP2/0)小鼠模型。實(shí)驗(yàn)分為三組：骨髓重建對照組，腫瘤復(fù)發(fā)組，單純T細(xì)胞組，T細(xì)胞與TJ-5共同作用組。小鼠的死亡歸結(jié)為GVHD相關(guān)死亡和腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)死亡進(jìn)行評價(jià)。觀察60天，記錄各組GVHD體重變化，繪制臨床評分和生存曲線。對GVT靶器官脾臟和骨髓進(jìn)行病理檢測；流式細(xì)胞術(shù)檢測TJ-5對

10、骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0凋亡壞死和細(xì)胞周期的影響，對DC表面趨化因子CCR7表達(dá)的影響和對受者脾臟內(nèi)Treg的比例的影響，以進(jìn)一步明確保留GVT效應(yīng)的可能機(jī)制。
　　【結(jié)果】 TJ-5治療組與GVT對照組60天存活率分別為50%與12.6%，荷瘤死亡率組間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.04)，TJ-5組GVT靶器官骨髓，脾臟組織病變減輕，腫瘤細(xì)胞浸潤減少，與單純GVT對照組相比，并未觀察到削弱的GVT改變。在體外實(shí)驗(yàn)條件下，TJ-5可劑

11、量依賴的促進(jìn)骨髓瘤SP2/0細(xì)胞的的凋亡與壞死，并使SP2/0細(xì)胞的增殖生長周期停滯在G1期；TJ-5可抑制LPS導(dǎo)致的DC表面趨化分子CCR7的表達(dá)上調(diào)；經(jīng)TJ-5治療后的GVHD小鼠脾臟內(nèi)Treg的含量明顯增高，差異據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　【結(jié)論】TJ-5治療荷瘤GVHD小鼠過程中對移植物GVT效果并無明顯的抑制作用。TJ-5保留GVT效應(yīng)的機(jī)制可能與直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，趨化因子CCR7表達(dá)下調(diào)，受體Treg含

12、量增加有關(guān)。
　　第四部分單純宿主MyD88基因缺陷無GVHD保護(hù)作用
　　【目的】探討宿主來源MyD88分子在異基因骨髓移植后急性GVHD進(jìn)展中的作用，為TJ-5臨床應(yīng)用時(shí)間窗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　【方法】以野生型(wt)或 MyD88基因敲除(ko) BALB/c(H-2Kd)小鼠作為受體，C57BL/6(H-2Kb)小鼠為供體，建立小鼠急性GVHD模型。觀察30天，以生存期，體重變化，GVHD臨床評分，病理，炎性因

13、子水平作為GVHD評價(jià)指標(biāo)。激光共聚焦技術(shù)評價(jià)供者源性細(xì)胞在宿主體內(nèi)的增殖情況，確定細(xì)胞類型與效應(yīng)；ELISA檢測受體內(nèi)LPS的水平差異；免疫組化檢測腸上皮細(xì)胞的增殖與凋亡；蛋白印跡法檢測腸上皮細(xì)胞內(nèi)MyD88依賴性Cox-2信號的表達(dá)；實(shí)時(shí)定量PCR檢測腸上皮緊密連接蛋白(ZO-1，claudin-3和occludin)的表達(dá)評價(jià)腸屏障功能；淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)技術(shù)檢測受體MyD88敲除對異基因淋巴細(xì)胞增殖的影響。
　　【結(jié)果】在相

14、同的預(yù)處理實(shí)驗(yàn)條件下，MyD88-/-小鼠較wt宿主表現(xiàn)出更嚴(yán)重的GVHD：生存時(shí)間，體重下降，GVHD臨床評分均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；MyD88敲除加重肝臟和小腸病理損傷，增加外周循環(huán)中 LPS的含量和組織中 GVHD相關(guān)炎性分子(TNF-α、IL-4和IL-12)的表達(dá)。相對于野生型受體而言，MyD88-/-小鼠脾臟，小腸和肝臟內(nèi)有更多的H-2kb陽性的供者細(xì)胞和DC浸潤，腸上皮細(xì)胞凋亡增加，增殖減少。MyD88依賴的Co

15、x-2的表達(dá)在MyD88-/-小鼠腸上皮細(xì)胞中顯著下降(P<0.05)；腸上皮緊密連接分子ZO-1，claudin-3和occludin在MyD88-/-GVHD小鼠腸道和肝臟中的表達(dá)均明顯下降，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MyD88基因缺陷未明顯降低混培體系中的異基因淋巴細(xì)胞增殖。
　　【結(jié)論】宿主MyD88分子在GVHD進(jìn)展中起到一定的保護(hù)作用，機(jī)制與減少供者效應(yīng)細(xì)胞的浸潤，增加腸上皮屏障的穩(wěn)定性與黏膜保護(hù)性分子C