兩個抗病性增強的水稻類病變突變體基因的圖位克隆及其功能的初步分析.pdf

1、由水稻條紋病毒(rice stripe virus，RSV)引起的水稻條紋葉枯病以及由革蘭氏陰性細菌黃單胞桿菌水稻變種(Xanthomonasoryzaepv.oryzae, Xoo)引起的水稻白葉枯病(bacterial leaf blight，BLB)是水稻生產(chǎn)過程中兩種重要的病害。盡管目前已經(jīng)就這兩種病害的防治和抗性品種的培育做了大量的工作，但病害依舊會悄悄卷土重來。從長期的實踐來看，培育新的抗病品種和挖掘新的抗病相關基因仍是控制

2、這些病害的最直接和最有效手段。水稻類病變突變體由于其類似于過敏性反應(hypersensitive response，HR)而出現(xiàn)的局部細胞死亡現(xiàn)象以及對于一些水稻病害的顯著抗性，使其成為水稻抗病分子研究過程中一個重要的工具。我們通過乙基甲磺酸(ethyl methane sulfonate，EMS)誘變的方式獲得了水稻突變體庫，并從中篩選獲得了兩株具有類病變表型的水稻類病變突變體，暫時分別命名為Z1834和Z1828。本實驗主要是分別

3、對這兩個水稻類病變突變體的目標基因進行了分子克隆，并初步分析了它們的功能。研究的主要內(nèi)容如下:
　　1.依據(jù)RAP-DB數(shù)據(jù)中心(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)的水稻基因序列信息分別克隆Z1834和Z1828這兩個突變體的候選基因，并通過構建超表達載體分別轉(zhuǎn)化Z1834和Z1828突變體材料，以期完成功能互補實驗。實驗結(jié)果表明，這兩個候選基因分別被確證為這兩個突變體的目標基因。其中，Z1834目標基因

4、位于9號染色體，無內(nèi)含子，片段長度為2772 bp，編碼一個抗性相關蛋白，基因序列中包含有一個NB-ARC結(jié)構域;而Z1828目標基因位于3號染色體，由11個外顯子組成，長2022 bp，編碼一個蛋白合成因子，序列中擁有RanBP2型鋅指結(jié)構域和延伸因子EF1A結(jié)構域。此外，Z1828目標基因于11號染色體含有一個同源度高達98％的同源基因。
　　2.通過構建含有GFP的融合表達載體，分別對兩個目標基因進行原生質(zhì)體細胞和煙草葉片細

5、胞的亞細胞定位。實驗結(jié)果表明，Z1834目標基因被定位于原生質(zhì)體細胞和煙草葉片細胞的細胞質(zhì)內(nèi)某一囊狀結(jié)構內(nèi)，且呈晶體狀;而Z1828目標基因產(chǎn)物則廣泛分布于細胞膜、細胞質(zhì)以及細胞核內(nèi)。
　　3.分別提取兩個突變體材料的根、莖、葉和穗等組織中的RNA，并進行半定量PCR以便了解兩個目標基因的組織特異性表達情況。結(jié)果顯示，兩個目標基因在水稻各組織中均有一定量的表達，其中，Z1834目標基因在水稻根中的表達量相對較低，而Z1828目標基

6、因則在各組織中未見明顯差異。
　　4.利用實時熒光定量PCR實驗分別了解兩個目標基因在類病變表型出現(xiàn)前后的表達差異。實驗結(jié)果表明，在類病變表型出現(xiàn)之前，Z1834目標基因在突變體中的表達量與野生型材料未見明顯差異，但類病變表型出現(xiàn)之后，突變體材料中目標基因的表達則出現(xiàn)了明顯的升高;而Z828目標基因的表達量則恰恰相反，類病變表型出現(xiàn)前，其在突變體中的表達量稍高于野生型材料，但類病變表型出現(xiàn)后，突變體材料中目標基因的表達則出現(xiàn)了顯著

7、的下降，并低于野生型材料。
　　5.分別于幼苗期類病變表型未出現(xiàn)之前(T1)、幼苗期類病變表型出現(xiàn)之后(T2)以及成株期類病變表型完全出現(xiàn)(T3)等三個時期，對于野生型和突變體材料分別接種水稻白葉病菌P6小種，以了解兩個目標基因的誘導表達情況。結(jié)果顯示，Z1834目標基因同時受到物理損傷和Xoo侵染二者的影響。其中，T1期，Xoo的侵染能夠誘導目標基因表達量的上升，而T2和T3期，目標基因表達量未見明顯變化;Z1828目標基因則是

8、在整個T1～T3時期均未見明顯變化。
　　6.兩個突變體中PR基因的表達量分析顯示，Z1834突變體中，部分通路中的PR基因表達量顯著升高，但PR2、PR5以及PR9等卻出現(xiàn)了明顯的下降;Z1828突變體中，絕大部分PR基因均出現(xiàn)了明顯的上升。
　　7.TB（trypan blue，臺盼藍）和DAB（diaminobenzidine，二氨基聯(lián)苯胺）染色結(jié)果顯示，Z1834和Z1828突變體均在其葉片上的類病斑處出現(xiàn)了明顯細胞