一種新型殼聚糖聚合物在骨組織工程中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:制備一種新型的殼聚糖聚合物—水凝膠，并使其具備以下功能和特性:對(duì)細(xì)胞分裂增值有促進(jìn)作用;可成為多種細(xì)胞、藥物、生物活性物質(zhì)的載體;能作為活性組織細(xì)胞生長(zhǎng)的支架;促進(jìn)骨組織再生愈合。
　　方法:1）以天然殼聚糖、明膠為原料，先按多種配比與化學(xué)交聯(lián)劑京尼平、離子交聯(lián)劑甘油-2-磷酸二鈉進(jìn)行雙重交聯(lián)，再把可在符合初始設(shè)計(jì)要求規(guī)定時(shí)間范圍內(nèi)成膠的殼聚糖水凝膠樣品制備成多個(gè)不同配比的水凝膠細(xì)胞培養(yǎng)基，然后對(duì)所有培養(yǎng)基樣品進(jìn)行骨髓間充質(zhì)

2、干細(xì)胞接種，最后以相差顯微鏡觀察水凝膠培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況為標(biāo)準(zhǔn)，初步篩選出適合細(xì)胞生長(zhǎng)的殼聚糖水凝膠制備方案。2）選用多種常用的骨生物工程材料檢測(cè)方法對(duì)初篩制備出的水凝膠進(jìn)行理化特性方面檢測(cè)，包括對(duì)水凝膠進(jìn)行表面電鏡掃描、振蕩剪切流變學(xué)、體外釋放動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，測(cè)定剛度及表面結(jié)構(gòu)。在生物學(xué)特性檢測(cè)方面，對(duì)水凝膠細(xì)胞巢細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行熒光染色激光共聚焦掃描、細(xì)胞活力增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞誘導(dǎo)遷移實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)PCR測(cè)定人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨基因的表達(dá)、免疫組化

3、法測(cè)定ALP表達(dá)，以及新西蘭大白兔橈骨缺損修復(fù)模型實(shí)驗(yàn)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及體內(nèi)外成骨特性，進(jìn)一步篩選出更好的水凝膠配比。
　　結(jié)果:1）通過水凝膠理化特性檢測(cè)和體內(nèi)外成骨實(shí)驗(yàn)的篩選實(shí)驗(yàn)，篩選后的水凝膠制備流程和配比為:1.85％殼聚糖溶液、純水、1.8％明膠溶液，按4∶1∶1比例混勻攪拌30Min后加熱至35℃，再加入濃度為50mmol/8ul、體積比35∶1的京尼平溶液化學(xué)交聯(lián)20Min，再加入濃度0.8g％ml、體積比160∶

4、1的甘油-2-磷酸二鈉離子交聯(lián)劑混勻攪拌5Min實(shí)現(xiàn)離子交聯(lián)過程，放置37度溫箱孵育120Min。2）水凝膠表面電鏡掃描顯示，水凝膠表面呈多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔表面欠光滑，孔徑隨水凝膠中京尼平濃度的增加而逐漸增大。水分子含量高，利于液體交換，可提供適合細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境。3）流變學(xué)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，水凝膠剛性模量變化范圍在0.1437±0.0100kPa和3.5787±0.3200kPa之間;粘彈性模量在0.0026±0.0005kPa和0.0150

5、±0.0085 kPa之間。水凝膠原位成膠的時(shí)間在10-133Min之間。隨著京尼平濃度的增加，水凝膠原位成膠速度加快，成膠明顯縮短，剛性模量G'(Kpa)增加、粘彈性模量G”(Kpa)增加。配比4-1+ Nx(12x，16x，8x)成膠時(shí)間、表面剛度更符合要求。4）激光共聚焦掃描顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，所有配比為4-1+ Nx系列的水凝膠培養(yǎng)基均能支持細(xì)胞正常增殖、分化。配比為4-1+12x的水凝膠，細(xì)胞分化、生長(zhǎng)狀態(tài)最好，細(xì)胞增殖速度最快。

6、5）采用ELISA法檢測(cè)到攜載不同濃度rhBMP-2的水凝膠均有良好的體外釋放動(dòng)力學(xué)效果，所有濃度的水凝膠載體均能穩(wěn)定持續(xù)地釋放不同濃度的BMP-2，早期表現(xiàn)為爆發(fā)性釋放，7天后呈持續(xù)穩(wěn)定的緩慢釋放，28天時(shí)仍達(dá)6.40％±0.55％。釋放濃度、釋放速度與載體BMP-2原始濃度呈正相關(guān)。6）接種于水凝膠培養(yǎng)基中的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞采用MTT法觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組第1-7天的增殖速度明顯超過對(duì)照組，且增殖峰值提前。7)采用小室法觀察法觀察細(xì)胞遷

7、移實(shí)驗(yàn)顯示，所有攜載活性誘導(dǎo)因子rhBMP-2的水凝膠培養(yǎng)基對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞都有誘導(dǎo)作用，但不同rhBMP-2濃度的水凝膠載體對(duì)同種細(xì)胞，誘導(dǎo)作用不同，實(shí)驗(yàn)組中rhBMP-2濃度500ng/ml的水凝膠載體，誘導(dǎo)作用最強(qiáng)。8）實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)培養(yǎng)于攜帶不同濃度BMP-2的水凝膠上的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨基因mRNA的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，所有攜載BMP-2的實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比，低濃度的BMP-2對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨基因的表達(dá)即有顯著的促

8、進(jìn)作用，隨攜載濃度增加促進(jìn)作用加強(qiáng)。9）在新西蘭大白兔橈骨骨缺損模型的體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后4周、8周、12周成骨情況觀察，X線照片、micro-CT掃描三維重建成像及特殊成骨染色三個(gè)方面均顯示:攜帶BMP-2及自體成骨細(xì)胞的水凝膠實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異、實(shí)驗(yàn)組在骨形成及修復(fù)方面有明顯優(yōu)勢(shì)。
　　結(jié)論:制備、篩選出了新型水凝膠，以生物工程材料評(píng)價(jià)方法對(duì)其理化特性、體、內(nèi)外生物學(xué)特性進(jìn)行檢測(cè)、評(píng)估，認(rèn)為其制備方案及流程合理