CS-siCkip-1修飾的功能化種植體的成骨功效及體內(nèi)應(yīng)用研究.pdf

1、近年來(lái)，伴隨著牙種植技術(shù)的迅速發(fā)展，種植修復(fù)已成為缺牙患者所選擇的主要修復(fù)方式之一，臨床種植成功率可達(dá)到95％左右。但是，系統(tǒng)性骨疾?。ㄈ绻琴|(zhì)疏松）患者仍存在骨形成能力弱、骨結(jié)合不良等現(xiàn)象，增加了種植失敗的風(fēng)險(xiǎn)。在提高骨質(zhì)疏松患者種植體骨結(jié)合的多種途徑中，種植體的生物功能化被認(rèn)為是一種極具前景的方法。酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(Ckip-1)參與骨代謝，是成骨細(xì)胞分化和骨形成過(guò)程中至關(guān)重要的負(fù)調(diào)控因素，通過(guò) RNA干擾技術(shù)全身應(yīng)用Cki

2、p-1siRNA（siCkip-1）對(duì)其進(jìn)行基因沉默，能夠提高骨質(zhì)疏松條件下的骨形成。因此，采用 siCkip-1對(duì)種植體表面進(jìn)行修飾有望促進(jìn)種植體表面骨形成，從而提高骨質(zhì)疏松患者的種植體成功率。
　　本研究首先采用殼聚糖（CS）作為基因載體，通過(guò)靜電作用與siCkip-1形成CS/siCkip-1復(fù)合物，將該復(fù)合物加載于堿熱處理種植體表面，制備得到CS/siCkip-1功能化的種植體，并對(duì)該種植體表面進(jìn)行表面微觀結(jié)構(gòu)和表面性狀分

3、析；然后應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，評(píng)價(jià) siCkip-1的轉(zhuǎn)染情況及該細(xì)胞在種植體表面的增殖和成骨分化水平；最后將種植體植入骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)，初步探索該種植體在骨質(zhì)疏松條件下早期骨結(jié)合能力。通過(guò)全面評(píng)價(jià) Ckip-1siRNA的作用，證實(shí)其在種植體表面應(yīng)用的可行性，為骨質(zhì)疏松種植體表面siRNA功能化修飾提供依據(jù)，為功能化種植體的表面設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)。
　　第一部分 CS/siCkip-1功能化種植體的構(gòu)建及表面性狀分析
　　目的：

4、構(gòu)建CS/siCkip-1功能化種植體并對(duì)其表面性狀進(jìn)行分析，為后續(xù)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)提供模型。
　　方法：TA-CS/siCkip-1種植體的制備：制備殼聚糖/Ckip-1siRNA（CS/siCkip-1）復(fù)合物，馬爾文激光粒度分析儀測(cè)量該復(fù)合物的粒徑及zeta電位。純鈦種植體（PT）經(jīng)過(guò)在NaOH溶液中加熱處理，形成堿熱處理鈦（TA）。將CS/siCkip-1復(fù)合物加載在TA表面，制備形成TA-CS/siCkip-1種植體。

5、　　TA-CS/siCkip-1種植體的表面形狀分析：掃描電鏡（SEM）觀察PT、TA和TA-CS/siCkip-1表面微觀形貌。Cy-3標(biāo)記siCkip-1，激光共聚焦逐層掃描觀察siCkip-1在試樣表面分布情況。接觸角系統(tǒng)獲取液滴圖像并測(cè)量各組試樣表面接觸角，評(píng)價(jià)試樣表面親水性。將試樣浸入BSA蛋白24 h后使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定試樣表面蛋白吸附水平。
　　結(jié)果：殼聚糖和Ckip-1siRNA通過(guò)靜電作用結(jié)合，形成CS

6、/siCkip-1復(fù)合物。該復(fù)合物粒徑大小約為235.9±25.6 nm，zeta電位為+13.7±2.77 mV。
　　堿熱處理后形成TA，呈現(xiàn)多孔的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。CS/siCkip-1復(fù)合物能夠均勻的加載在TA種植體表面，還可進(jìn)入到多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)部，形成厚約2000 nm的siCkip-1層。
　　接觸角測(cè)量結(jié)果顯示，堿熱處理使種植體親水性增加，TA-CS/siCkip-1親水性低于TA組，但明顯高于PT。對(duì)各組試樣表面蛋白

7、吸附進(jìn)行定量，TA-CS/siCkip-1組蛋白吸附量顯著高于PT及TA組。
　　結(jié)論：殼聚糖和siCkip-1能夠在靜電作用下形成粒徑分布較一致、呈正電性的CS/siCkip-1復(fù)合物。CS/siCkip-1復(fù)合物能夠均勻地加載在堿熱處理后的種植體表面，構(gòu)建出的TA-CS/siCkip-1種植體表現(xiàn)出較高的親水性和蛋白吸附水平。
　　第二部分 CS/siCkip-1功能化種植體對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rBMMSC）生物學(xué)行

8、為的影響
　　目的：觀察siCkip-1的細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況，評(píng)價(jià)TA-CS/siCkip-1種植體對(duì)rBMMSCs增殖及成骨分化能力的影響。
　　方法：全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，將細(xì)胞接種于TA-CS/siCkip-1表面，培養(yǎng)48 h后激光共聚焦觀察siCkip-1的細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況。
　　rBMMSCs接種1、4、7天后CCK-8法檢測(cè)拋光組（PT）、堿熱處理組（TA）、堿熱處理-殼聚糖組（TA-CS）、堿

9、熱處理-殼聚糖/siRNA對(duì)照組（TA-CS/siNC）和堿熱處理-殼聚糖/siCkip-1組（TA-CS/siCkip-1）試樣表面細(xì)胞增殖情況，評(píng)價(jià)細(xì)胞活性。成骨誘導(dǎo)7、14、21天后分別檢測(cè)試樣表面堿性磷酸酶（ALP）表達(dá)、膠原分泌、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）礦化水平，評(píng)價(jià)成骨分化能力。
　　結(jié)果：培養(yǎng)出rBMMSCs細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)良好，選擇2-4代細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究。細(xì)胞接種48 h后，在殼聚糖的保護(hù)和攜帶作用下，幾乎所有

10、的siCkip-1轉(zhuǎn)染進(jìn)入rBMMSCs細(xì)胞內(nèi)，分布于細(xì)胞核的周?chē)?br>　　與PT組相比，TA、TA-CS、TA-CS/siNC和TA-CS/siCkip-1促進(jìn)了表面rBMMSCs細(xì)胞增殖，且這四組試樣表面細(xì)胞增殖水平?jīng)]有顯著性差異。siCkip-1在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮RNA干擾作用，促進(jìn)了ALP的表達(dá)、膠原分泌和細(xì)胞外基質(zhì)礦化。
　　結(jié)論：CS/siCkip-1功能化的種植體表現(xiàn)出良好的細(xì)胞生物相容性，siCkip-1能夠高效的轉(zhuǎn)

11、染入胞，促進(jìn)rBMMSCs的成骨分化。
　　第三部分 CS/siCkip-1功能化的種植體對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨結(jié)合效應(yīng)的研究
　　目的：建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，探究TA-CS/siCkip-1種植體植入后對(duì)骨質(zhì)疏松條件下早期骨結(jié)合的影響。
　　方法：對(duì)雌性SD大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，術(shù)后3個(gè)月后micro-CT掃描評(píng)價(jià)大鼠骨質(zhì)疏松模型建立情況。
　　將堿熱處理（TA）、堿熱處理-殼聚糖組（TA-CS）、堿熱處理-殼聚糖/

12、siRNA對(duì)照組（TA-CS/siNC）和堿熱處理-殼聚糖/siCkip-1組（TA-CS/siCkip-1）植入骨質(zhì)疏松大鼠雙側(cè)股骨。植入后不同時(shí)期（4 w、12 w）評(píng)價(jià)骨結(jié)合情況，具體方法如下：新生骨的Micro CT重建分析；組織學(xué)染色（VG染色）觀察；骨-種植體界面元素掃描分析；機(jī)械力學(xué)測(cè)定（拔出實(shí)驗(yàn)）。
　　結(jié)果：雙側(cè)卵巢切除3個(gè)月后，Micro CT結(jié)果顯示大鼠骨質(zhì)疏松建立成功。種植體植入4周及12周后骨結(jié)合分析結(jié)果

13、：Micro CT重建及定量分析可見(jiàn)，各組種植體周?chē)行鹿切纬桑琓A-CS/siCkip-1骨量最多且結(jié)構(gòu)致密；組織學(xué)VG染色顯示：TA-CS/siCkip-1組新骨連續(xù)，與種植體緊密結(jié)合；對(duì)骨-種植體界面元素掃描，各組種植體表面新骨的組成結(jié)構(gòu)類(lèi)似于正常骨，且TA-CS/siCkip-1組骨厚度顯著高于其它組；各組種植體拔出力均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，TA-CS/siCkip-1組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)最大拔出力和剪切強(qiáng)度均顯著高于其它組。