腸道病毒分型生物傳感器基因芯片的研制.pdf

1、目的： 應(yīng)用生物傳感器基因芯片專利技術(shù)，建立一種無需大型設(shè)備、基因芯片信號經(jīng)生物傳感器原位放大后可肉眼判讀的腸道病毒分型檢測系統(tǒng)，使之成為一種特異性高、成本低、耗時(shí)短、能在基層醫(yī)院普及應(yīng)用的腸道病毒分型生物傳感器基因芯片。 方法： 1）在本實(shí)驗(yàn)室生物傳感器基因芯片技術(shù)專利和前期研究基礎(chǔ)上，在GenBank中查找368株4型腸道病毒的VP1基因完整序列，用Clustalx軟件進(jìn)行比對分析，找到其相對保守性序列及分型

2、特異性序列，并查閱文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)VP1區(qū)通用引物及分型探針。將探針固定在功能化薄膜生物傳感器基片上，制備出相應(yīng)的腸道病毒分型檢測基因芯片。 2）利用腸道病毒分型質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)不同型別探針與目的片段雜交的Tm值差異，在特定離子濃度條件下進(jìn)行洗脫，最終獲得特異性的分型鑒別信號，以建立相應(yīng)的檢測方法并驗(yàn)證其特異性。 3）用本芯片系統(tǒng)對腸道病毒臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測分型，同時(shí)相應(yīng)的PCR產(chǎn)物通過測序及blast分析確定其分型，將

3、芯片雜交結(jié)果與測序結(jié)果進(jìn)行比較，通過Kappa分析對其進(jìn)行一致性分析，進(jìn)一步驗(yàn)證本芯片系統(tǒng)的特異性。 4）將EV71質(zhì)粒做為模板通過倍比稀釋，制備不同濃度的EV71質(zhì)粒模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后與芯片雜交，探索本芯片系統(tǒng)檢測的靈敏度。并將腸道病毒臨床標(biāo)本進(jìn)行100倍的稀釋，進(jìn)一步驗(yàn)證本芯片系統(tǒng)檢測的靈敏度。 結(jié)果： 本研究結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)室前期生物傳感器基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ)上，本款腸道病毒分型檢測生物傳感器基因芯片較好

4、地實(shí)現(xiàn)了分型信號的檢測，達(dá)到了不需要任何大型設(shè)備，就可準(zhǔn)確判讀檢測結(jié)果的水平。此外，本研究還表明： 1）選用腸道病毒經(jīng)典通用引物292/222對VP1基因區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，并證實(shí)其擴(kuò)增良好，在引物擴(kuò)增范圍內(nèi)設(shè)計(jì)分型探針，blast分析證實(shí)各型探針特異性良好。 2）應(yīng)用本生物傳感器基因芯片系統(tǒng)對腸道病毒質(zhì)粒進(jìn)行檢測，表明其檢測結(jié)果與實(shí)際情況完全一致，本芯片系統(tǒng)能將本芯片所設(shè)計(jì)的4型腸道病毒有效檢出，提示本芯片系統(tǒng)對腸道病毒分型檢

5、測具有很高的特異性。 3）應(yīng)用本芯片系統(tǒng)對20例確診腸道病毒感染的臨床標(biāo)本及20例正常對照臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測分型，結(jié)果表明20例預(yù)測陽性的臨床標(biāo)本中，本芯片法20例均能檢出，通過一次雜交，就能準(zhǔn)確予以分型，雖然只有17例獲得了測序結(jié)果，但其型別分類上，特異性100％相符。利用Kappa分析對本芯片檢測結(jié)果的一致性進(jìn)行Kappa分析，表明Kappa值為0．8500（>0．75），一致程度相當(dāng)滿意，說明本芯片對這4種腸道病毒的分型特異

6、性良好。 4）本實(shí)驗(yàn)的RT—PCR擴(kuò)增體系，穩(wěn)定可靠，擴(kuò)增效率較高。將EV71質(zhì)粒進(jìn)行倍比稀釋，結(jié)果表明芯片系統(tǒng)在質(zhì)粒進(jìn)行1：107倍稀釋的情況下，芯片檢測信號強(qiáng)度與模板濃度較高的情況下檢測信號強(qiáng)度基本相同。同時(shí)對臨床標(biāo)本進(jìn)行100倍稀釋，芯片檢測信號強(qiáng)度與模板濃度較高的情況下檢測信號強(qiáng)度基本相同，表明本芯片系統(tǒng)具有良好的敏感性，完全能夠滿足臨床檢測需求。 結(jié)論： 本芯片系統(tǒng)集生物傳感器技術(shù)、基因芯片技術(shù)為一體，