大鼠KIAA0280在神經(jīng)元凋亡模型中的表達研究及其克隆表達和純化.pdf

1、缺血性腦血管病是當今危及人類健康和生命的主要疾病之一，然而治療該病的有效方法相當缺乏。近年來，缺血性腦血管病機制和治療的研究已深入到基因水平，而研究腦缺血中差異表達的基因及其所編碼的蛋白質(zhì)在腦缺血損傷中的作用，以進一步探索腦缺血損傷的病理生理機制，已成為尋找治療缺血性腦血管病靶位基因和新途徑的熱點之一。 本實驗室前期工作中利用熒光差異顯示RT-PCR(FDDRT-PCR)技術(shù)研究了急性腦缺血大鼠中腦缺血區(qū)與非缺血區(qū)差異表達的基因

2、，得到了一條在腦缺血區(qū)明顯表達上調(diào)的基因，同源性分析發(fā)現(xiàn)該基因與人KIAA0280的同源性達95％，與小鼠的達97％，因而命名為大鼠KIAA0280；表達譜分析表明KIAA0280在腦組織中高度表達。為進一步探討大鼠KIAA0280在其他因素誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷過程中的表達是否發(fā)生變化，其是否在這個過程中發(fā)揮促進或抑制神經(jīng)元損傷的作用，我們建立了神經(jīng)元凋亡模型，初步探討大鼠KIAA0280在這些神經(jīng)元凋亡模型中的表達情況。同時，本課題進行了

3、大鼠KIAA0280的克隆表達和純化，以獲得大量高純度的蛋白質(zhì)，用于其后續(xù)的抗體制備、晶體結(jié)構(gòu)的預(yù)測及其相關(guān)功能的研究。 第一章大鼠KIAA0280在神經(jīng)元凋亡模型中的表達研究本章初步探討了大鼠KIAA0280在體外谷氨酸誘導(dǎo)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡模型、低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型和缺氧誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型中的表達的情況。 方法：大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元和小腦顆粒神經(jīng)元的分離和原代培養(yǎng)；建立谷氨酸誘導(dǎo)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡

4、模型、低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型和缺氧誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型；倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學改變；二乙酸熒光素(fluoresceindiacetate，F(xiàn)DA)染色檢測神經(jīng)元的代謝活性(metabolicactivity)和存活率(viability)；Hoechst33258染色觀察神經(jīng)元核及染色質(zhì)的形態(tài)變化；用本實驗室自制的大鼠KIAA0280多克隆抗體行WesternBlot蛋白免疫印跡法檢測大鼠KIAA0280蛋

5、白表達水平。 結(jié)果：成功建立了谷氨酸誘導(dǎo)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡模型、低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型和缺氧誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型；大鼠KIAA0280在谷氨酸誘導(dǎo)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡模型中的表達呈持續(xù)下降趨勢；大鼠KIAA0280在缺氧誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型中的表達呈早期上升后下降的趨勢；大鼠KIAA0280在低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型中的表達呈上升趨勢。 第二章大鼠KIAA0280的克隆表達和純化本研究

6、首先選用帶有His-tag的原核表達載體PQE30，在大腸桿菌中進行了大鼠KIAA0280的克隆表達和純化，得到了His-KIAA0280融合蛋白的包涵體；隨后，為表達可溶蛋白做準備，本實驗構(gòu)建和克隆了大鼠KIAA0280的酵母表達載體pPICZB-KIAA0280，并將其轉(zhuǎn)化入酵母GS115、X-33和KM71H中。 第一節(jié)大鼠KIAA0280在大腸桿菌中的克隆表達和純化方法：PCR擴增大鼠KIAA0280的ORF；TA克隆該

7、基因并酶切鑒定；構(gòu)建帶有His-tag的原核表達載體PQE30-KIAA0280后行酶切、測序鑒定；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)表達；行SDS-PAGE分析；并用本實驗室自制的KIAA0280多克隆抗體進行WesternBlot特異性鑒定；經(jīng)可溶性分析后，在變性條件下用NI-NTAHis-Bind樹脂純化蛋白質(zhì)包涵體。 結(jié)果：成功構(gòu)建了原核融合表達載體PQE30-KIAA0280；成功誘導(dǎo)表達了分子量

8、約27KDa的His-KIAA0280融合蛋白質(zhì)；純化后得到融合蛋白的包涵體。 第二節(jié)大鼠KIAA0280酵母重組表達質(zhì)粒的克隆和轉(zhuǎn)化方法：PCR擴增大鼠KIAA0280的ORF；TA克隆該基因并酶切鑒定；構(gòu)建pPICZB-KIAA0280表達載體并行酶切、測序鑒定；將pPICZB-KIAA0280線性化后，電轉(zhuǎn)化入酵母GS115、X-33和KM71H中；然后，我們行PCR分析目標基因是否整合進GS115、X-33和KM71H基