絲狀支原體山羊亞種腺苷磷酸化酶的提取與酶譜分析.pdf

1、近年來(lái)，支原體的耐藥現(xiàn)象己在各地出現(xiàn)，很多原米敏感的抗生素，不同程度的產(chǎn)生耐藥，久治不愈的病例屢見(jiàn)不鮮，盡管各地報(bào)道的結(jié)果不完全一致，但敏感率不斷下降的趨勢(shì)是相同的。肺炎支原體不侵入機(jī)體組織與血液，其致病首先通過(guò)頂端結(jié)構(gòu)粘附在宿主細(xì)胞表面，并伸出微管插入胞內(nèi)吸取營(yíng)養(yǎng)、損傷細(xì)胞膜，繼而釋放出神經(jīng)(外)毒素、磷酸酶、核酸酶、抗原、過(guò)氧化氫等代謝產(chǎn)物引起細(xì)胞的溶解、上皮細(xì)胞的腫脹與壞死，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生的抗體也可能參與了上述病理?yè)p傷。據(jù)報(bào)道所有支

2、原體都會(huì)代謝產(chǎn)生腺苷磷酸化酶。綜上所述，支原體代謝產(chǎn)生的酶在支原體致病及分類鑒定方面起劍的作用有待研究。目前，對(duì)支原體代謝酶的研究國(guó)外報(bào)道很少，國(guó)內(nèi)沒(méi)有正式報(bào)道。 由絲狀支原體山羊亞種(即PG3株)所引起的山羊傳染性胸膜肺炎是山羊傳染病中最為流行的疾病之一，目前這種病仍廣泛發(fā)生在中亞、北非、中東等養(yǎng)羊聚集的國(guó)家和地區(qū)，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)造成嚴(yán)重危害。本實(shí)驗(yàn)利川改良的Hartleys培養(yǎng)基，縮短山羊支原體的培養(yǎng)時(shí)間，通過(guò)對(duì)山羊支原體的培養(yǎng)觀

3、察，為進(jìn)一步研究提供材料，同時(shí)增強(qiáng)對(duì)山羊支原體的認(rèn)識(shí)，對(duì)腺苷磷酸化酶進(jìn)行了初步研究，力求為支原體的致病機(jī)理的研究以及臨床鑒定診斷治療提供更多的理論依據(jù)。 1.腺苷磷酸化酶提取時(shí)間的確定 目的：確定在培養(yǎng)后的哪個(gè)時(shí)間段支原體代謝產(chǎn)生的腺苷磷酸化酶活性最高，為腺苷磷酸化酶的提取提供依據(jù)。方法：分別取PG3標(biāo)準(zhǔn)株和分離株48h培養(yǎng)液0.1ml接種于1 0ml的改良Hartleys液體培養(yǎng)基中，接種48管，37℃恒溫培養(yǎng)。每隔6

4、h取3管(2ml/管)，測(cè)定OD值和pH值，同時(shí)從3管中各取2ml測(cè)酶活。結(jié)果：山羊支原體在改良后的Hartleys培養(yǎng)基中生長(zhǎng)適應(yīng)期為0～1 8h，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為18～60h，穩(wěn)定期為60～72h，培養(yǎng)72h后進(jìn)入衰亡期，在60h內(nèi)pH值下降較快，從pH7.5降到6.671，培養(yǎng)后第60h至第96h，pH值下降緩慢，保持在pH6.671～6.510；培養(yǎng)48h左右，酶活性最高。結(jié)論：把培養(yǎng)后48h作為腺苷磷酸化酶提取時(shí)間。 2.

5、腺苷磷酸化酶的提取純化 目的：為酶的特性研究作準(zhǔn)備的同時(shí)檢測(cè)純化方法的可行性。方法：通過(guò)離心、超聲波裂解、鹽析、透析、超濾、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析和親和層析等一系列蛋白質(zhì)分離純化方法對(duì)腺苷磷酸化酶進(jìn)行分離純化，并用SDS-PAGE和總酶活、總蛋白含量、純化倍數(shù)等參數(shù)檢測(cè)純化效果。結(jié)果：腺苷磷酸化酶粗酶液SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，腺苷磷酸化酶相對(duì)分子質(zhì)量約為29.1KDa，主要以胞內(nèi)可溶形式存在；純化倍數(shù)達(dá)117，純化所得

6、的腺苷磷酸化酶進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示了一條分子量約為29.1kDa的單一條帶。結(jié)論：腺苷磷酸化酶得到很好的純化，也說(shuō)明分離純化方法是可行的。 3.腺苷磷酸化酶酶學(xué)特性的研究 目的：了解腺苷磷酸化酶酶學(xué)特性，為更深入的研究提供理論依據(jù)。方法：配制pH分別為6.0、6.5、6.8、7.0、7.3、7.5和8.0的磷酸鉀緩沖液，測(cè)定不同pH時(shí)的酶活；測(cè)定反應(yīng)溫度分別為30、34、37、40、45、50、55、60

7、、65和70℃時(shí)的酶活；以腺苷、肌營(yíng)和尿苷為底物，研究腺苷磷酸化酶對(duì)不同底物的催化活性，反應(yīng)體系中各底物的濃度均為1.5 mmol/l。結(jié)果：腺苷磷酸化酶有較好的熱穩(wěn)定性，37℃左右酶活力變化不大，最適反應(yīng)溫度為50℃，當(dāng)溫度高于55℃時(shí)，酶活力迅速下降；酶活的最適pH值為7.0，在堿性條件下，腺苷磷酸化酶的活力下降不大，但在酸性條件下，酶活下降很快，pH6.0時(shí)，酶活只有最適pH時(shí)的一半左右；腺苷磷酸化酶對(duì)腺苷顯示了最大的催化活性，而

8、肌苷是非常差的底物，對(duì)肌苷的酶比活是腺苷的5.6％，對(duì)尿苷幾乎沒(méi)有催化活性。結(jié)論：由培養(yǎng)液pH值變化測(cè)定知培養(yǎng)48h時(shí)的培養(yǎng)液pH值在7.0附近，而酶活的最適pH值為7.0，這證明把培養(yǎng)斤48h作為腺苷磷酸化酶提取時(shí)間是正確的。 4.腺苷磷酸化酶酶譜分析 目的：檢測(cè)此腺苷磷酸化酶是由幾種亞基構(gòu)成，有無(wú)同工酶存在。方法：對(duì)腺苷磷酸化酶粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE(在分離膠中加入0.1％的腺苷)，電泳后，用25％的異丙醇使酶復(fù)