黑麥氫離子焦磷酸化酶(ScHP1)基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、本研究中首先以小麥及其近緣屬作為研究材料，對(duì)秦嶺黑麥、旱雀麥、沙融山羊草、帶芒草、長(zhǎng)穗偃麥草和普通小麥(L2、L4和CN16)在低鉀條件下的生理情況進(jìn)行了探索。然后通過(guò)RACE的方法從秦嶺黑麥中分離得到氫離子焦磷酸化酶基因的cDNA全長(zhǎng)，并且通過(guò)同源克隆、高效熱不對(duì)稱(chēng)PCR等方法，獲得黑麥氫離子焦磷酸化酶的基因全長(zhǎng)，進(jìn)一步對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式進(jìn)行分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1.通過(guò)水培的方法篩選了耐低鉀的材料，同時(shí)結(jié)合材料自

2、身的特性，確定了本實(shí)驗(yàn)克隆所需要的材料。
　　2.根據(jù)其他物種中克隆得到的氫離子焦磷酸化酶基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)RT-PCR和RACE的方法首次從秦嶺黑麥中克隆得到ScHP1 cDNA全長(zhǎng)2629bp，其中包括2289bp的開(kāi)放閱讀框和340bp的3'非編碼區(qū)。開(kāi)放閱讀框編碼762個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子量為79.4 kDa。并通過(guò)高效熱不對(duì)稱(chēng)PCR和普通PCR的方法獲得基因全長(zhǎng)為4354bp。
　　3.對(duì)ScHP1進(jìn)行跨

3、膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其有14個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。將克隆得到的序列與普通小麥、烏拉爾圖小麥、節(jié)節(jié)麥、二穗短柄草、大麥、水稻和玉米的氫離子焦磷酸化酶進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn):氨基酸序列5'端變化相對(duì)較大，而在3'端高度保守。并且含有4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別是GGG，DVGADLVGKVE，DNVGDNNGD，EYYT,GNTTAA。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)ScHP1顯示該蛋白由兩條鏈組成，1個(gè)鉀離子結(jié)合位點(diǎn)以及10個(gè)鎂離子結(jié)合位點(diǎn)。
　　4.將ScHP1連入含有黃色

4、熒光蛋白基因的質(zhì)粒pA7-YFP進(jìn)行融合表達(dá)，然后通過(guò)基因槍法將對(duì)照質(zhì)粒pA7-YFP和重組質(zhì)粒pA7-ScHP1-YFP轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，對(duì)照質(zhì)粒pA7-YFP在整個(gè)細(xì)胞中都有熒光出現(xiàn)，而重組質(zhì)粒僅在細(xì)胞膜上出現(xiàn)了黃色熒光，說(shuō)明該基因在黑麥中定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。
　　5.將秦嶺黑麥在低N、P、K和低溫、干旱、高鹽下進(jìn)行72h脅迫，檢測(cè)ScHP1表達(dá)情況。熒光定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ScHP1在秦嶺黑麥中的表達(dá)具有組織特異性