人視網膜色素上皮細胞在兩種Bruch膜替代物上的生長研究比較.pdf

1、背景:
　　 年齡相關性黃斑變性(Age-related Macular Degeneration，AMD)是發(fā)達國家55歲以上人群視力損害和致盲的首要病因。在我國，隨著人口的老齡化和衛(wèi)生保健水平的不斷提高，AMD的發(fā)病率也越來越高。根據臨床表現的不同，AMD分為萎縮型，（又稱干性或非滲出性）和滲出型（又稱濕性或盤狀黃斑變性）兩類。其中對視力危害最大的是濕性AMD患者，常常因黃斑部多發(fā)性視網膜色素上皮脫離(Retinal Pig

2、ment Epithelium Detachment，RPED)、脈絡膜新生血管形成(choroidal neovascularization，CNV)致視網膜下出血或出血性視網膜脫離或玻璃體積血，最終演變?yōu)楹髽O部廣泛的瘢痕形成，使黃斑中心凹的視功能喪失殆盡。因此科研人員一直在努力探索新的技術試圖終止或逆轉這種視力喪失，這些技術包括光動力療法(Photodynamictherapy, PDT)3、放療4、黃斑轉位5和藥物治療。PDT相對

3、于激光光凝最主要的優(yōu)勢在于:可以用于黃斑下CNV的治療;不損害神經視網膜和脈絡膜而選擇性地阻塞病理狀態(tài)的新生血管，避免暗點的形成。盡管PDT為臨床治療AMD帶來了希望，但是仍存在一些問題，限制了其廣泛應用:首先其適應癥范圍狹窄，TAP研究6表明PDT對于典型性CNV占病變50％以上的CNV和隱匿性CNV有效，但僅有14％的患者治療后兩年內視力有提高7;其次，CNV復發(fā)率高，一般每隔3個月就需要重復治療一次7;第三，PDT治療后也可能導致

4、視網膜脫離等嚴重并發(fā)癥8;第四，該療法費用昂貴，患者的經濟壓力巨大。藥物治療主要包括干擾素9、thalidomide10、曲安奈德11和抗血管內皮細胞生長因子(Vascular Epithelial Growth Factor, VEGF)12,13。目前多項研究證實抑制血管內皮生長因子(VEGF)作用的藥物有著比較樂觀的前景:Krzystolik等14在靈長類動物實驗中證實Ranibizumab可以降低CNV的發(fā)生率且減少病灶的滲漏。

5、近來有報道超過35％的經典型CNV的濕性AMD患者在使用Ranibizumab治療，一年內視力明顯提高15,16，未來有可能通過玻璃體腔持續(xù)不斷的給藥，提高藥物治療的有效性。目前認為抗VEGF制劑（包括抗VEGF抗體及因子）是治療濕性AMD的主要方法，主要是通過阻斷VEGF作用于血管內皮細胞的生物活動來達到治療濕性AMD的目的，這些生物活動包括視網膜下間隙新生血管復合物形成過程中活躍的有絲分裂和血管通透性增加17。但是抗VEGF制劑治療

6、濕性AMD仍具有局限性，表現在如下幾個方面:第一，抗VEGF制劑只能阻止未完全發(fā)育的新生血管管壁的滲漏，而對于AMD患者已經形成的視網膜下新生血管膜則無效;第二，新生血管的形成還涉及其它信號通道的參與，是一個多因素的調控事件，因此僅僅阻斷多個調控因子之一的VEGF細胞內信號可能并不能完全抑制新生血管的生成18;第三，抗VEGF制劑的全身吸收同時也擾亂了生理狀態(tài)下的血管形成，尤其是影響了心肌梗死后冠狀動脈側枝循環(huán)的建立與恢復以及傷口的愈合

7、19;第四，抗VEGF制劑需要反復、多次玻璃體腔注射，這些操作本身增加了發(fā)生視網膜脫離和眼內炎的風險12。由于上述不利因素的存在，仍有必要探索治療AMD的其它可行辦法。
　　 要想找到一種有效治療AMD的方法，首先就要弄清楚AMD的病理發(fā)生機制。視網膜色素上皮(Retinal Pigment Epithelium，RPE)在AMD的病理發(fā)生上占據了重要位置。RPE由排列規(guī)則的六角形色素上皮細胞單層組成，構成了視網膜的外屏障。RP

8、E細胞頂部的細胞外基質稱為視網膜下間隙，由光感受器間的基質(interphotoreceptormatrix，IPM)20,21充填。正常生理狀態(tài)下，RPE細胞的微絨毛朝向視網膜下間隙，通過IPM與光感受器緊密連接22。頂部的細胞膜發(fā)出微絨毛，形成致密的網狀組織，光感受器外節(jié)插入其間，形成兩層廣泛的接觸?；撞康募毎は蚣毎|內陷，形成許多折疊，附著在Bruch膜(Bruch's membrane，BM)上。Bruch膜是一個五層結構，

9、厚約1-4um，是連接RPE基底膜和脈絡膜毛細血管的重要結構。此外RPE細胞可以分泌抑制血管生成的色素上皮源性因子(PigmentEpithelial-Derived Factor PEDF)23、血管上皮生長因子(VascularEpithelial Growth Factor VEGF)24以及細胞外基質。目前認為AMD患者CNV可能與RPE細胞分泌VEGF和PEDF比率失調有關25。
　　 RPE是光感受器進行新陳代謝所需

10、物質的重要傳遞途徑。RPE的結構和功能對維持正常視網膜結構和功能起著至關重要的意義。在人衰老的過程中，氧張力增加可導致RPE和脈絡膜毛細血管損傷，進而引發(fā)Bruch膜和脈絡膜慢性炎癥反應。RPE和脈絡膜毛細血管損傷和炎癥可導致異常細胞外基質的形成，這些異常細胞外基質可改變供給視網膜和RPE的營養(yǎng)物質的轉運，可能會促成RPE和視網膜的進一步損害26，如視網膜、RPE和脈絡膜毛細血管的萎縮以及CNV的長入。這些衰老體征最終促進了AMD的病理

11、學發(fā)生27。AMD在病理發(fā)生學上主要分為早期和晚期2種類型。早期AMD以玻璃膜疣(drusen)的形成和RPE異常為特征。晚期AMD包括兩種臨床類型28:萎縮型/干性型和滲出型/濕性，后者主要以脈絡膜新生血管形成，跨過受損的Bruch膜長入上皮下和或視網膜下區(qū)域1導致RPE細胞的成片丟失和RPE-光感受器之間的屏障破壞為特征30。無論哪一種類型的AMD，導致AMD患者視力喪失的主要原因都是RPE片狀丟失和視網膜下纖維血管長入，破壞了RP

12、E與光感受器之間的屏障，導致與RPE緊密相連的光感受器細胞的丟失和凋亡31。
　　 近年來，隨著對AMD發(fā)病的分子和細胞機制的進一步了解，有人提出了利用健康RPE移植治療AMD的概念?；赗PE的潛在調節(jié)功能以及對疾病過程的調控，理論上認為RPE移植不僅可以恢復視網膜正常的解剖功能、重建光感受器和脈絡膜毛細血管之間的代謝屏障，還能提供光感受器所需的支持功能?；诖?，很多學者先后開展了人RPE移植的研究。
　　 早期人RP

13、E移植的研究多是同種異體移植，受體移植排斥反應導致移植后視功能恢復不明顯。后期雖然開展了自體RPE細胞移植，但效果不盡如人意。究其原因，大多數研究均采用RPE細胞懸液或RPE移植片進行視網膜下移植，移植后這些細胞懸液或植片不能正常地貼附在病變的Bruch膜上，以孤立的細胞團的方式存活，不能在黃斑中心凹下形成單層上皮細胞層;即使細胞能夠重新貼附，其分化的功能也明顯受到限制。而RPE細胞只有保持正常的細胞極性才得以發(fā)揮生理功能，雜亂無章分布

14、的RPE細胞無法重建功能。有研究表明在RPE移植的過程中供體健康RPE細胞很難附著在受體病變的Bruch膜上，而供體RPE細胞移植后必須重新附著在受體基質上以避免凋亡。
　　 供細胞貼附的Bruch膜的質量和數量直接決定了種植的人胚胎RPE細胞的命運45,50。生理狀態(tài)下，RPE細胞自然貼附于Bruch膜，后者構成了RPE細胞的基底膜。許多移植研究把這一層視為移植RPE細胞重新附著的支架6。Bruch膜厚約1-4um，主要有分為

15、5層:視網膜色素上皮基底膜;內膠原層;彈力層;外膠原層和脈絡膜毛細血管基底膜。Bruch膜由Ⅰ型和Ⅳ型膠原;粘連蛋白;纖維連接蛋白和彈性蛋白構成，支持RPE細胞的貼附、視網膜營養(yǎng)物質和代謝產物的轉運。Bruch膜的年齡和類型顯著影響移植細胞的重新附著46。貼附在Bruch膜基底層（尤其是年輕供體）可以使RPE細胞的存活率，增殖率和融合能力較貼附Bruch膜其它層高。有研究發(fā)現Bruch膜的內層膠原層的老化改變會抑制附著于Bruch膜的R

16、PE細胞重新增殖17。此外老化的黃斑下Bruch膜并不支持移植RPE細胞的生存和分化45-46。未經治療的老化黃斑下Bruch膜也不支持人胚胎RPE細胞的生存和分化，但經過適當治療后，Bruch膜卻可以在器官培養(yǎng)研究中支持移植RPE的生存和分化33。大量研究發(fā)現51-56， RPE細胞在健康的膜性基質上生長能夠形成單細胞層，保持完整的生物學特征。
　　 基于上述發(fā)現，人們認識到重建Bruch膜，恢復視網膜下間隙的解剖和功能是視網

17、膜RPE移植首要解決的關鍵問題之一57。如果通過重建受體Bruch膜，使移植的健康RPE細胞在重建的Bruch膜上正常生長、分化，就可能移植恢復視網膜正常的解剖功能、重建光感受器和脈絡膜毛細血管之間的代謝屏障，恢復位于RPE上方的光感受器的視覺功能。為此許多實驗室先后研究了各種生物的或合成的Bruch膜支架，試圖模仿Bruch膜的功能，提高RPE移植的成功率。到目前為止，合成高分子化合物如交聯膠原58、明膠59、纖維蛋白原60、生物組織

18、如Descement膜55、晶狀體前囊61-63和羊膜64-65已經被嘗試用作RPE移植中的Bruch膜替代物的研究。首先RPE細胞在這些基質上生長、分化形成上皮細胞單層，然后再進行RPE單層細胞—Bruch膜性替代物的移植。但至今這些Bruch膜替代物均存在不同程度的缺陷，難以應用于臨床，如交聯膠原由于厚度、穿透性差、不易降解等因素在移植過程中容易損傷視網膜66;明膠則不能為供體RPE細胞提供一個理想的附著面，難以保證移植細胞在受體病

19、變或缺失的Bruch膜上存活59;以纖維蛋白原60為基質載體的移植RPE細胞在視網膜下間隙以多個散在的細胞片形式存在，難以維持細胞的極性，同樣不是理想的基質膜的選擇。盡管從患者身上直接獲取的晶狀體前囊和Descement膜，可以避免移植排斥反應的發(fā)生，但手術操作可能帶來創(chuàng)傷以及移植步驟繁瑣的問題63，因此亦不是理想的Bruch膜替代物。
　　 從上述Bruch膜替代物研究發(fā)現，要使RPE移植成功，移植RPE細胞必須重新貼附在結構

20、特性與Bruch膜相類似的物質上，才能維持正常的RPE細胞極性，并且能夠在視網膜下間隙準確定位33。作為Bruch膜的替代物，首先應該在厚度、滲透性、生物相容性方面與Bruch膜相似，并有助于細胞貼附。此外，還應該有助于維持RPE上皮的特征，即功能性緊密連接、頂部微絨毛、光感受器外節(jié)層的吞噬作用和規(guī)則的上皮單層。
　　 組織工程學技術的廣泛應用為RPE移植帶來了新的希望。作為RPE細胞生長的基質膜，可生物降解并具有生物相容性的聚

21、酯聚合物如PLLA和PLGA（主要由聚酯纖維Polyester組成）67可以有效地支持RPE細胞生長，明顯改善體外培養(yǎng)的RPE細胞的生存率和極性，已經得到美國FDA批準使用于臨床。但僵硬的聚酯纖維在視網膜下間隙移植時容易損傷視網膜，而且降解過程中有可能產生神經視網膜毒性，在一定程度上限制了聚酯纖維作為理想膜性基質的應用33。
　　 近十年來組織工程學納米技術的應用，再次激發(fā)了人類研發(fā)類似原位細胞外基質(native extrac

22、ellular matrix，ECM)的膜性支架的興趣。原位ECM不僅為細胞提供生理支持，還為細胞貼附、遷徙提供具有特殊腺體的基質，進而通過各種生長因子調控細胞的增殖和功能。原位ECM的一個顯著特征是具有納米級大小的生理結構。膠原纖維和彈性纖維等結構蛋白的纖維直徑在幾十至幾百納米范圍內，納米級蛋白纖維相互整合形成的篩網為組織提供力量和彈性68。早在19世紀60年代就有納米級特征影響細胞行為的報道6。20～50nm的蝕刻硅膠納米級表面可以

23、促進神經細胞貼附和羥基化酶的作用70;納米級表面結構可以促進成骨細胞的粘附71。有報道當纖維直徑在60～200nm之間，生長在炭納米纖維上的成骨細胞粘附、增殖和堿性磷酸酶的活動均有增強，而其它種類的細胞如成纖維細胞，軟骨細胞和肌細胞的貼附并不受影響72。提示:納米級表面特征促進粘附蛋白的形成，進而影響細胞行為73。
　　 基底膜是一種非常重要的ECM，厚約40-120nm，是所有上皮和內皮細胞生存的基礎。Bruch膜作為眼內的一

24、種基底膜，在維持RPE的正常功能方面發(fā)揮著重要功能。Bruch膜纖維主要由Ⅳ型膠原和粘蛋白納米纖維組成，膜上的纖維、微孔等均以納米級大小存在。作為理想的膜性支架，其結構和生物學功能應盡可能與原位ECM類似，即化學組成和生理學結構一致68。微孔納米纖維膜(Electrospun nanofibers，EPN)由于表面結構與人體基底膜相似，是目前最具有發(fā)展前途的一種生物學材料68。基于上述研究，我們推測EPN可能可以充當Bruch膜的理想替

25、代物，促進RPE細胞正常生長、分化，為RPE移植治療濕性AMD患者帶來新的曙光。盡管人們對聚酯膜(Polyester)作為移植中RPE細胞生長支架的研究有一定認識，近年來蝕刻多空技術的出現可能會進一步改善聚酯膜作為RPE細胞生長支架的性能，據我們所知，目前尚未見相關報道，本課題將通過EPN與蝕刻多空聚酯膜(Etched porepolyester, PET)兩種生物材料的對比研究，進一步明確二者的優(yōu)缺點及未來作為RPE移植中Bruch膜

26、理想替代物的可能，為RPE移植成功治療AMD帶來新的希望。本研究分為三個部分:
　　 第一部分:人胚胎RPE細胞在微孔聚酰胺納米纖維膜和多空聚酯膜上的生長研究比較。應用倒置熒光顯微鏡、免疫熒光染色和Western Blot法比較研究人胚胎RPE細胞在EPN和PET兩種潛在的 Bruch膜替代物上的生長、分化情況;借助掃描電鏡比較兩種替代物與在體Bruch膜的纖維排列的異同，為理想Bruch膜替代物的研究提供初步理論基礎。

27、　　 第二部分:成人RPE細胞在微孔聚酰胺納米纖維膜和多空聚酯膜上的生長研究比較。建立成人RPE細胞培養(yǎng)的方法，采用第一部分的方法，進一步比較上述兩種材料作為理想Bruch膜替代物的可能性。
　　 第三部分:兩種Bruch膜替代物植入P21RCS大鼠視網膜下間隙的組織學觀察。通過玻璃體切割手術分別把EPN和PET植入視網膜下間隙，通過組織切片初步觀察兩種替代物植入視網膜下間隙的生物相容性。
　　 結果:
　　

28、1.EPN在超微結構上與在體Bruch膜類似;
　　 2.EPN和PET均支持體外培養(yǎng)的人胚胎RPE細胞的生長和分化，轉換鈣離子濃度可以促進RPE細胞在上述兩種Bruch膜替代物上的分化。免疫熒光染色以及Western Blot均證實上述兩種替代物上的RPE細胞能夠正常分化;
　　 3.盡管EPN支持人胚胎RPE細胞的貼壁生長、分化，但在常規(guī)培養(yǎng)第10天開始出現部分RPE細胞單層變薄，尤其是EPN游離面上的RPE細胞單層

29、不均一，呈網格狀改變;培養(yǎng)第15天，EPN游離面和塑料附著面均出現不同程度的RPE細胞脫落，膜表面暴露或破裂;而PET上培養(yǎng)的人胚胎RPE細胞單層雖然不規(guī)則，但能夠完整地附著在膜表面;
　　 4.通過高密度種植、轉換培養(yǎng)基鈣離子濃度，可以成功培養(yǎng)老年人RPE細胞，細胞形態(tài)與人胚胎RPE細胞類似;
　　 5.高密度種植條件下，EPN上的成人RPE細胞生長分化優(yōu)于PET上的成人RPE細胞;
　　 6.作為Bruch膜

30、的理想替代物，除了具備纖維排列與Bruch膜內膠原層相類似、具有納米級表面特征及滲透性特點外，大而平滑的表面可能更有利于RPE細胞單層的維持;
　　 7.P21RCS大鼠視網膜下間隙植入物的初步組織學研究提示EPN和PET在視網膜下間隙均具有生物相容性。
　　 結論:
　　 1.EPN由于結構與Bruch膜相似，是一種具有發(fā)展前景的Bruch膜替代物;
　　 2.EPN的游離面不能支持人胚胎RPE細胞單層