骨保護(hù)素對(duì)破骨細(xì)胞及其前體黏附結(jié)構(gòu)和融合的影響.pdf

1、骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡是動(dòng)物主要的健康問(wèn)題之一。破骨細(xì)胞的分化和活化，在健康動(dòng)物及患病動(dòng)物骨重塑中起著至關(guān)重要的作用。破骨細(xì)胞具有骨吸收活性，由單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞譜系的造血前體細(xì)胞融合形成。破骨細(xì)胞通過(guò)偽足小體，一種特異性的黏附結(jié)構(gòu)，附著在細(xì)胞外基質(zhì)上。偽足小體可形成F-actin環(huán)，類似于進(jìn)行骨吸收的破骨細(xì)胞形成的環(huán)狀封閉帶。骨保護(hù)素(OPG)和核因子κB受體激活劑(RANK)都是腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員，通過(guò)和RANK配

2、體(RANKL)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合，調(diào)控破骨細(xì)胞形成和功能。RANKL通過(guò)激活RANK，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化;而OPG連接至RANKL，抑制破骨細(xì)胞形成。已有研究發(fā)現(xiàn)了OPG作用于破骨細(xì)胞分化、融合及黏附的一些重要細(xì)節(jié)。但這些研究主要集中在編碼破骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物，潛在的融合因子和黏附相關(guān)調(diào)控因子基因的表達(dá)，通過(guò)體外阻斷，或過(guò)表達(dá)方式來(lái)研究。因此，OPG抑制破骨細(xì)胞分化、融合和黏附的許多重要分子機(jī)制仍不明確。本研究以25 ng/mL M-CSF和

3、30 ng/mL RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化形成的破骨細(xì)胞為研究對(duì)象，在分化過(guò)程中添加不同濃度OPG進(jìn)行處理，通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定、實(shí)時(shí)細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析(RTCA)、免疫印跡法(Western blot)等技術(shù)手段，探索OPG對(duì)破骨細(xì)胞黏附結(jié)構(gòu)和融合的影響，揭示相關(guān)調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步闡明OPG對(duì)破骨細(xì)胞形成及功能的抑制作用提供了理論依據(jù)。研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.OPG對(duì)不同分化階段破骨細(xì)胞的形成及功能的影響
　　為了研究O

4、PG對(duì)不同分化階段破骨細(xì)胞的黏附及活性的影響，本實(shí)驗(yàn)采用M-CSF和RANKL處理RAW264.7細(xì)胞，培養(yǎng)1、3、5、7d后，各組分別添加80 ng/mL OPG作用24 h?？咕剖崴嵝粤姿崦福═RAP）染色和免疫熒光檢測(cè)破骨細(xì)胞分化和黏附能力的變化，RTCA監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線變化，Western blot檢測(cè)TRAP、RANK、integrinβ3、matrix metalloproteinase9(MMP9)、cathepsin

5、K、carbonic anhydraseⅡ(CAⅡ)及vesicular-type H+-ATPaseA1(V-ATPaseA1)蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，OPG處理顯著增強(qiáng)分化初期細(xì)胞(1 d)的存活、增殖及黏附能力，并促進(jìn)RANK和integrinβ3表達(dá)量顯著增高(p＜0.01)。相反，和對(duì)照組相比，OPG抑制成熟的破骨細(xì)胞(3-7 d)的分化及黏附結(jié)構(gòu)的形成，并顯著降低了TRAP、RANK、integrinβ3、MMP9、ca

6、thepsin K、CAⅡ及V-ATPase A1標(biāo)志性蛋白的表達(dá)水平(p＜0.01)。說(shuō)明OPG對(duì)于破骨細(xì)胞分化不同階段的生物效應(yīng)是有差異的，促進(jìn)破骨細(xì)胞前體的黏附和存活，抑制各階段破骨細(xì)胞的分化，并降低分化至中末期的成熟的破骨細(xì)胞活性。
　　2.OPG對(duì)破骨細(xì)胞黏附結(jié)構(gòu)的影響及調(diào)控機(jī)理
　　為了揭示OPG對(duì)破骨細(xì)胞黏附結(jié)構(gòu)、黏附相關(guān)蛋白表達(dá)及分布的影響，本實(shí)驗(yàn)采用M-CSF和RANKL處理RAW264.7細(xì)胞3d后，在無(wú)

7、血清培養(yǎng)條件下，加入不同濃度OPG（0、20、40、80 ng/mL）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，TRAP染色檢測(cè)不同劑量OPG對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響，掃描電子顯微鏡(SEM)、RTCA及激光共聚焦技術(shù)觀察破骨細(xì)胞外周黏附結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化，Western blot檢測(cè)Pyk2和Src酪氨酸磷酸化水平。結(jié)果表明，OPG能夠抑制破骨細(xì)胞的分化，使細(xì)胞黏附結(jié)構(gòu)收縮且呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。結(jié)合激光共聚焦和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OPG導(dǎo)致破骨細(xì)胞P

8、yk2發(fā)生去磷酸化，降低了Pyk2在細(xì)胞外周黏附結(jié)構(gòu)區(qū)域的表達(dá)及分布，誘導(dǎo)Tyr402 Pyk2和Tyr416 Src向細(xì)胞中央聚集，提高了其在細(xì)胞中央的表達(dá)量，但顯著降低了Tyr527 Src磷酸化水平(p＜0.01)，增強(qiáng)了Pyk2和Src在破骨細(xì)胞中央?yún)^(qū)域的聯(lián)系。表明，破骨細(xì)胞為了適應(yīng)OPG的調(diào)控，將Src作為銜接蛋白，代償減少的Pyk2，并與Pyk2一起從破骨細(xì)胞外周黏附區(qū)域向中心區(qū)域轉(zhuǎn)移。說(shuō)明，OPG通過(guò)調(diào)控破骨細(xì)胞內(nèi)Pyk2

9、和Src磷酸化及其在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，破壞破骨細(xì)胞黏附結(jié)構(gòu)。
　　3.OPG調(diào)控破骨細(xì)胞黏附結(jié)構(gòu)的Ca2+、ERK和p38 MAPK信號(hào)通路
　　為了探討Ca2+和MAPKs信號(hào)通路在OPG調(diào)控破骨細(xì)胞黏附結(jié)構(gòu)中的作用，本實(shí)驗(yàn)以細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑Bapta-AM(5μM)，ERK抑制劑U0126(5μM)和p38抑制劑SB202190(10μM)與OPG（40 ng/mL）聯(lián)合作用破骨細(xì)胞。3h后，TRAP染色、SEM、RT

10、CA、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot分別檢測(cè)破骨細(xì)胞的生成、活力、黏附結(jié)構(gòu)和形態(tài)變化，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度[Ca2+]i、Pyk2和Src的磷酸化狀態(tài)。結(jié)果表明，OPG抑制了破骨細(xì)胞生成和黏附結(jié)構(gòu)的形成，顯著降低了[Ca2+]i、Pyk2和Src-pY527磷酸化水平(p＜0.01)，并使Src-pY416磷酸化水平顯著增高(p＜0.01)。Bapta-AM、U0126和SB202190明顯抑制了OPG對(duì)破骨細(xì)胞分化和黏附結(jié)構(gòu)的

11、作用。Bapta-AM和U0126使降低的[Ca2+]i、Pyk2和Src-pY527磷酸化水平恢復(fù)至對(duì)照組水平，而SB202190沒有這種作用。這三種抑制劑都抑制了OPG引起的Src-pY416磷酸化水平升高。說(shuō)明，OPG通過(guò)Ca2+和ERK信號(hào)通路破壞破骨細(xì)胞黏附結(jié)構(gòu)，激活Src使其作為銜接蛋白補(bǔ)充減少的磷酸化Pyk2，而p38 MAPK信號(hào)通路可能在這過(guò)程中發(fā)揮著不同的作用。
　　4.OPG抑制破骨細(xì)胞及其前體融合的調(diào)控機(jī)理

12、
　　為了揭示OPG對(duì)破骨細(xì)胞及其前體融合的分子調(diào)控機(jī)理，本研究利用OPG(40 ng/mL)單獨(dú)或聯(lián)合ATP(100μM)作用破骨細(xì)胞48 h，TRAP染色、RTCA、Western blot和激光共聚焦分別檢測(cè)破骨細(xì)胞及前體細(xì)胞的分化、融合率、融合關(guān)鍵因子(CD44、CD47、DC-STAMP、ATP6V0D2及Cx43)的表達(dá)量和定位變化。結(jié)果表明，OPG抑制了多核破骨細(xì)胞的形成，與OPG組比較，OPG與ATP聯(lián)合作用，多核

13、破骨細(xì)胞（以細(xì)胞核數(shù)目分類）數(shù)目顯著增多(p＜0.01)。與對(duì)照組比較，OPG僅減少破骨細(xì)胞前體CD47的表達(dá)量，并使多核的破骨細(xì)胞CD44、CD47、DC-STAMP、ATP6V0D2和總Cx43的表達(dá)水平顯著下降(p＜0.01);與OPG組比較，OPG與ATP聯(lián)合作用，這些融合相關(guān)因子的表達(dá)量顯著上升(p＜0.01)。而OPG降低了破骨細(xì)胞及前體細(xì)胞中CD44+、CD47+、DC-STAMP+、ATP6V0D2+、Cx43+細(xì)胞在總