Jak2信號(hào)缺陷可選擇性抑制DC而對(duì)LPS所致內(nèi)毒性休克產(chǎn)生保護(hù).pdf

1、本文主要內(nèi)容如下：
　　 一、研究背景：
　　內(nèi)毒素性休克臨床特征表現(xiàn)為嚴(yán)重的毒血癥，伴低血壓和器官低灌注，且對(duì)液體復(fù)蘇反應(yīng)欠佳，是ICU中致死的最常見病因之一，死亡率高達(dá)20%～80%，僅在美國(guó)每年超過(guò)10萬(wàn)名患者死于該癥。
　　 DC屬固有免疫細(xì)胞，其通過(guò)攝取抗原、分泌促炎性因子等參與固有免疫應(yīng)答。同時(shí)，DC作為體內(nèi)最重要的抗原提呈細(xì)胞，也是介導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵細(xì)胞，其機(jī)制為：①加工、處理、提呈外源性抗原

2、，提供T細(xì)胞活化的第一信號(hào)；②激活的DC高表達(dá)共刺激分子，提供T細(xì)胞活化所需的第二信號(hào)；③產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，輔助淋巴細(xì)胞活化。因而，以DC為代表的APC被認(rèn)為是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁。
　　 本研究建立誘導(dǎo)性Jak2基因敲除小鼠模型，并獲如下發(fā)現(xiàn)：①Jak2基因缺陷可抑制DC的固有免疫功能，表現(xiàn)為發(fā)育受阻，低表達(dá)MHC 分子和共刺激分子，且在LPS 刺激下分泌細(xì)胞因子的能力下降；②Jak2基因缺陷并不影響DC介導(dǎo)適應(yīng)性免

3、疫應(yīng)答的能力；③Jak2基因敲除小鼠對(duì)LPS所致的內(nèi)毒素性休克有很強(qiáng)抵抗作用。
　　 二、誘導(dǎo)性Jak2基因敲除小鼠模型的建立及功能分析：
　　 1.Cre+/+Jak2fl/fl小鼠模型建立
　　 本文用Jak2 fl/fl小鼠和他莫昔芬誘導(dǎo)性Cre轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行雜交，成功復(fù)制誘導(dǎo)性Jak2基因敲除小鼠模型。對(duì)8 周齡雄性Cre+/+Jak2 fl/fl小鼠腹腔注射他莫昔芬（1.0mg/40g 體重）/次，每天

4、一次，連續(xù)5天，注射溶劑的同窩雄性小鼠作為對(duì)照。最后一次注射2 周后處死小鼠，培養(yǎng)BMDC和脾細(xì)胞，提取蛋白，借助Western blot分析Jak2表達(dá)，以驗(yàn)證基因敲除效果。結(jié)果顯示；對(duì)照小鼠BMDC高表達(dá)Jak2，而他莫昔芬誘導(dǎo)的小鼠DC中未檢出Jak2，脾細(xì)胞也獲類似結(jié)果，表明在他莫昔芬誘導(dǎo)后，Cre+/+Jak2 fl/fl小鼠Jak2表達(dá)缺失。
　　 2.Jak2基因敲除小鼠DC功能的改變：
　　 (1)Jak

5、2基因缺陷抑制DC發(fā)育：采集Ja k2-/-小鼠和對(duì)照小鼠骨髓細(xì)胞，用GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)分化為BMDC。結(jié)果證實(shí)：①Jak2基因缺陷組BMDC數(shù)量降低1.3 倍；②Jak2基因缺陷組脾細(xì)胞總數(shù)明顯降低，脾臟DC數(shù)量及在脾細(xì)胞中所占比例均降低；③Jak2基因缺陷組CD4+和CD8+T細(xì)胞百分比未見明顯變化。上述結(jié)果表明：Jak2 功能缺陷可明顯影響DC發(fā)育。
　　 (2)Jak2基因缺陷抑制DC成熟和分泌細(xì)胞因子：培養(yǎng)第9

6、天取部分DC，用LPS刺激24小時(shí)，于第10天收集DC，流式細(xì)胞術(shù)分析表型。
　　 結(jié)果顯示：①Jak2基因敲除組和對(duì)照組DC純度均大于85%；②Jak2基因敲除組BMDC表面MHC II 類分子和共刺激分子表達(dá)均明顯下降；③對(duì)單個(gè)脾DC檢測(cè)，所得結(jié)果與BMDC相似；④Jak2基因敲除組巨噬細(xì)胞表型改變類似于DC。上述結(jié)果提示：Jak2基因缺陷可抑制DC成熟。
　　 進(jìn)一步檢測(cè)Jak2缺陷對(duì)DC功能的影響。采集BMDC培

7、養(yǎng)上清，借助ELISA檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子分泌：①LPS刺激前，Jak2-/-和對(duì)照BMDC上清中均未能檢出IL-2、IL-6、IL-10和IL-12，Jak2-/-組可檢出低水平TNF-α；②LPS 刺激后，對(duì)照檢查組BMDC分泌大量促炎性細(xì)胞因子，而Jak2-/-BMDC所分泌相應(yīng)細(xì)胞因子水平明顯低于對(duì)照組；③LPS刺激后，Jak2-/-和野生型BMDC均未檢出IL-2和IL-10。述結(jié)果顯示：Jak2基因缺陷可明顯抑制DC分泌炎性細(xì)胞

8、因子。
　　 (3)Jak2缺陷不影響DC啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答：借助同種異體混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)DC刺激T細(xì)胞增殖的能力。經(jīng)射線照射的Jak2-/-和野生型BMDC與BALB/c小鼠T細(xì)胞共培養(yǎng)，用3 H標(biāo)記的胸腺嘧啶摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)T細(xì)胞增殖。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Jak2-/-DC能刺激T細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-10和IL-17，其分泌水平與野生型DC刺激T細(xì)胞分泌的水平無(wú)顯著差異。上述結(jié)果顯示，Jak2缺陷僅選擇性抑制DC

9、的固有免疫功能，但不影響DC介導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的功能。
　　 三、Jak2缺陷對(duì)致死性內(nèi)毒素性休克的保護(hù)作用：
　　內(nèi)毒素性休克屬經(jīng)典的炎性疾病，固有免疫異常在發(fā)病中起關(guān)鍵性作用。為探討Jak2 調(diào)控固有免疫的效應(yīng)，本文復(fù)制內(nèi)毒素性休克模型，方法為：給予他莫昔芬4 周，注射致死劑量LPS 至Jak2基因敲除和野生型小鼠腹腔內(nèi)。LPS 注射數(shù)小時(shí)后發(fā)現(xiàn)野生型小鼠的一般狀態(tài)明顯比Jak2基因敲除小鼠差，表現(xiàn)為發(fā)抖，蜷縮于鼠籠

10、一角。兩組小鼠內(nèi)毒素性休克存活率分別為22%和85%。
　　 四、Jak2調(diào)控DC功能的相關(guān)信號(hào)通路：
　　 1.Jak2缺失抑制STAT4、STAT45、STAT46活化
　　 Jak2可激活眾多STAT 分子而啟動(dòng)不同下游效應(yīng)。本文用LPS刺激Jak2缺陷型和野生型BMDC，30 分鐘后用100μl 裂解液RIPA裂解BMDC，借助Western blot 技術(shù)檢測(cè)下游信號(hào)分子的活化。結(jié)果顯示：Jak2缺陷型

11、BMDC裂解產(chǎn)物中，STAT4、STAT5和STAT6 磷酸化水平降低，而STAT1活化水平無(wú)明顯改變，裂解液中未檢出活化形式的STAT3。
　　 鑒于NF-κB是LPS的主要信號(hào)通路，我們檢測(cè)兩組DC在LPS 刺激后的磷酸化IκB-α及NF-κB 水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：LPS刺激30分鐘后，兩組間磷酸化的IκB-α和總NF-κB水平無(wú)明顯差異。
　　 2.Jak2-STAT5 通路促進(jìn)DC發(fā)育和成熟
　　 應(yīng)用STA

12、T5轉(zhuǎn)基因小鼠模型探討STAT5信號(hào)通路參與固有免疫應(yīng)答的效應(yīng)：①分離STAT5轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟細(xì)胞和骨髓細(xì)胞，誘導(dǎo)BMDC生成，Western檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠STAT5表達(dá)明顯高于對(duì)照小鼠；②STAT5轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠脾臟細(xì)胞數(shù)量明顯高于轉(zhuǎn)基因陰性的同窩對(duì)照小鼠和野生型對(duì)照小鼠；③流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，STAT5 過(guò)表達(dá)小鼠脾臟細(xì)胞中DC比例上調(diào)；④應(yīng)用GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)STAT5轉(zhuǎn)基因小鼠和對(duì)照小鼠骨髓細(xì)胞分化為DC，STAT5

13、 過(guò)表達(dá)可增加BMDC數(shù)量；⑤在刺激或未刺激條件下，STAT5 過(guò)表達(dá)BMDC中MHC II陽(yáng)性細(xì)胞群、CD80 陽(yáng)性細(xì)胞群、CD86 陽(yáng)性細(xì)胞群和CD54 陽(yáng)性細(xì)胞群比例均顯著上調(diào)；⑥LPS 刺激前后，STAT5轉(zhuǎn)基因BMDC分泌TNF-α和IL-6 水平與對(duì)照BMDC無(wú)顯著區(qū)別；⑦LPS 刺激后，STAT5 過(guò)表達(dá)BMDC分泌IL-12 水平比對(duì)照BMDC明顯升高。上述結(jié)果表明，Jak2 功能喪失可通過(guò)下調(diào)STAT5 而抑制DC發(fā)育

14、、成熟。
　　 3.Jak2-STAT6通路調(diào)節(jié)DC分泌炎性細(xì)胞因子
　　 鑒于STAT5 僅影響DC分泌IL-12，提示可能存在其他通路影響LPS 刺激后DC分泌炎性細(xì)胞因子。采集STAT4基因敲除小鼠、STAT6基因敲除小鼠和野生型對(duì)照小鼠骨髓細(xì)胞，誘導(dǎo)生成BMDC，第9天用LPS 刺激BMDC，24 小時(shí)后采集培養(yǎng)上清，ELISA檢測(cè)促炎性細(xì)胞因子分泌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　 (1)未受LPS 刺激，STAT6-

15、/-BMDC分泌IL-6和TNF-α水平明顯高于野生型對(duì)照組；各組BMDC均未檢出IL-12。由此提示：STAT6基因缺陷可降低BMDC對(duì)LPS的反應(yīng)性。
　　 (2)LPS 刺激24 小時(shí)后，STAT6-/-BMDC分泌TNF-α和IL-12 均明顯低于對(duì)照組，IL-6 水平與對(duì)照組無(wú)明顯差異?？紤]到刺激前基礎(chǔ)分泌水平，LPS 刺激促進(jìn)DC分泌炎性因子的效應(yīng)在STAT6 缺陷組明顯低于其他組。LPS 刺激后，野生型BMDC分泌

16、IL-6和TNF-α水平分別升高40 倍和244 倍，而STAT6 缺陷BMDC僅分別升高6.5和12.9 倍。
　　 (3)STAT4基因缺陷并不影響DC分泌炎性因子，LPS 刺激后，STAT4-/-BMDC分泌TNF-α升高倍數(shù)低于對(duì)照BMDC。
　　 LPS 刺激后，TAT4-/-BMDC分泌3種炎性細(xì)胞因子的水平與野生型對(duì)照無(wú)明顯差異。以上結(jié)果提示：Jak2 缺失可通過(guò)STAT6 途徑而影響DC分泌炎性細(xì)胞因子。

17、
　　 五、結(jié)論：
　　 1.Jak2基因敲除可抑制DC發(fā)育、成熟和分泌細(xì)胞因子。
　　 2.Jak2基因缺陷不影響DC引發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的功能。
　　 3.Jak2基因敲除小鼠對(duì)致死劑量LPS所致內(nèi)毒素性休克有抵抗作用，此效應(yīng)與抑制DC分泌炎性因子相關(guān)。
　　 4.Jak2 缺陷可影響STAT4、5、6活化；Jak2/STAT5信號(hào)通路參與調(diào)控DC發(fā)育、成熟；Jak2/STAT6通路參與調(diào)控DC