2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、目的:人們對(duì)側(cè)支血管生長(zhǎng)機(jī)制的認(rèn)識(shí),經(jīng)過(guò)數(shù)十年的努力,已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展,但仍有許多問(wèn)題需待深入的研究。本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)靜脈短路誘導(dǎo)側(cè)支血管生長(zhǎng)的模型和平滑肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型,研究了髂外動(dòng)脈的重塑、側(cè)支血管MCP-1的表達(dá)與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)系,從組織水平層面探討了巨噬細(xì)胞對(duì)側(cè)支血管生長(zhǎng)的作用,以及細(xì)胞外基質(zhì)降解和細(xì)胞基質(zhì)成分對(duì)平滑肌細(xì)胞粘著斑激酶的表達(dá)和增殖的影響。 方法: 1.動(dòng)物模型的制備 24只重3-4

2、kg成年大白兔,戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉(138 mM/Kg,腹腔注射)暴露股動(dòng)脈,進(jìn)行雙側(cè)股動(dòng)脈結(jié)扎和單側(cè)股動(dòng)脈結(jié)扎,并將一側(cè)結(jié)扎的股動(dòng)脈遠(yuǎn)側(cè)端經(jīng)側(cè)-側(cè)吻合連接到伴行的股靜脈上。動(dòng)物在相應(yīng)的存活時(shí)間點(diǎn)后處死,快速取樣,液氮中冷凍,然后用組織媒介劑(OCT復(fù)合物)包埋,貯存在-80℃待用。在單側(cè)股動(dòng)脈結(jié)扎的動(dòng)物未結(jié)扎側(cè)者為對(duì)照組,在雙側(cè)股動(dòng)脈結(jié)扎的動(dòng)物,未行股動(dòng)-靜脈吻合側(cè)為對(duì)照組。 2.細(xì)胞培養(yǎng)模型 原代培養(yǎng)的兔主動(dòng)脈平滑肌

3、細(xì)胞采用酶消化獲得。細(xì)胞培養(yǎng)液用199培養(yǎng)基和20%的胎牛血清,取第5代或6代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。對(duì)平滑肌粘著斑激酶及增殖的影響采用纖維連接蛋白(FN)和層粘連蛋白(LN)和Matrigel基膜成分三種材料。主要操作步驟是:12孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)放置直徑為18毫米的圓形蓋玻片,室溫下濃度為5ug/cm<'2> LN或者FN孵育2小時(shí),然后吸出剩余液,并仔細(xì)清洗,平滑肌細(xì)胞種植到頂層,在37℃和5%CO<,2>的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),直到細(xì)胞密度

4、達(dá)到75%為止。Matrigel基膜基質(zhì)膠的制備按公司提供的說(shuō)明書進(jìn)行。平滑肌細(xì)胞種植在膠內(nèi),然后加入培養(yǎng)液培養(yǎng)。對(duì)于Brdu標(biāo)記實(shí)驗(yàn),當(dāng)平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到75%左右時(shí),按照公司提供的說(shuō)明書加入Brdu,細(xì)胞培養(yǎng)1小時(shí)后進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。 3.免疫熒光檢測(cè) 組織或培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測(cè)均按常規(guī)的免疫熒光程序進(jìn)行。側(cè)支血管組織檢測(cè)的蛋白質(zhì)有RAM11(巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1),細(xì)胞粘附

5、分子(ICAM和VCAM)和Ki67(細(xì)胞增殖標(biāo)記物);另外部分實(shí)驗(yàn)骨骼肌用actin-phalloidin(FITC標(biāo)記)直接顯色,毛細(xì)血管用LectinBS1(TITC標(biāo)記顯色)。培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞的蛋白質(zhì)檢測(cè)包括粘著斑激酶(FAK)和磷酸化的粘著斑激酶(FAKpy397)。上述實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞核的染色根據(jù)需要分別采用7-AAD和TOFO3兩種細(xì)胞核的熒光染料。所有免疫熒光染色切片用Leica共聚焦顯微鏡拍照。 4.定量分析

6、 免疫熒光強(qiáng)度的定量測(cè)量用LeicaTCS SP共聚焦顯微鏡上配置的定量測(cè)量軟件完成,在整個(gè)測(cè)量過(guò)程中灰度值設(shè)定在0-255 Pixel強(qiáng)度水平。測(cè)量數(shù)據(jù)用SPSS軟件作統(tǒng)計(jì)分析。 免疫陽(yáng)性細(xì)胞的計(jì)數(shù)也是在Leica共聚焦顯微鏡下完成,細(xì)胞計(jì)數(shù)在40X物鏡下進(jìn)行,同時(shí)含有被檢測(cè)蛋白質(zhì)的陽(yáng)性產(chǎn)物和細(xì)胞核染色的細(xì)胞計(jì)為陽(yáng)性細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞和所有細(xì)胞核之比為被檢測(cè)物質(zhì)的陽(yáng)性率,測(cè)量結(jié)果用SPSS軟件作統(tǒng)計(jì)分析。 小結(jié):

7、1.本實(shí)驗(yàn)在動(dòng)靜脈短路模型中觀察到髂外動(dòng)脈的重塑以及在小腿處觀察到?jīng)]有側(cè)支血管的生長(zhǎng)但有毛細(xì)血管發(fā)生的事實(shí),為“血流切應(yīng)力是側(cè)支血管生長(zhǎng)驅(qū)動(dòng)力”的觀點(diǎn)提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù),同時(shí)也進(jìn)一步證明了缺血只能誘導(dǎo)毛細(xì)血管生成而非側(cè)支血管生長(zhǎng)。 2.在體實(shí)驗(yàn)揭示了MCP-1在側(cè)支血管的表達(dá)以及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的時(shí)間模式以及巨噬細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的降解和細(xì)胞增殖的密切關(guān)系。從組織學(xué)和細(xì)胞水平上為巨噬細(xì)胞對(duì)側(cè)支血管的生長(zhǎng)作用提供了重要的形態(tài)學(xué)證據(jù)。

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