水貂犬瘟熱競(jìng)爭(zhēng)ELISA及免疫膠體金診斷技術(shù)的研究.pdf

1、本試驗(yàn)將純化的犬瘟熱病毒與弗氏佐劑等量混合乳化后，分別于家兔背部皮下及腿部肌肉多點(diǎn)注射，免疫4次（每次間隔2周）后用純病毒加強(qiáng)免疫制備了兔抗犬瘟熱多克隆抗體，多克隆抗體采用飽和硫酸銨分級(jí)沉淀法純化，純化后抗體用SDS-PAGE鑒定提純效果，間接ELISA法檢測(cè)抗體純化前后的效價(jià)，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定提純后IgG含量;以犬瘟熱病毒為包被抗原，飽和硫酸銨純化的多克隆抗體為競(jìng)爭(zhēng)抗體建立了檢測(cè)犬瘟熱抗體的競(jìng)爭(zhēng)ELISA技術(shù);利用檸檬酸三鈉還原氯金酸

2、制備了40nm膠體金顆粒標(biāo)記單克隆抗體5B7，將單抗5B7、羊抗鼠IgG分別包被于NC膜作為檢測(cè)線（T線）和對(duì)照線（C線），金標(biāo)單抗2D6吸附于金標(biāo)墊，組裝試劑條，建立了檢測(cè)犬瘟熱病毒的膠體金免疫層析診斷方法。
　　 試驗(yàn)結(jié)果顯示:多抗片段為一條輕鏈和一條重鏈，大小分別為25KD和50KD;提純后抗體雜帶較少;純化前后抗體效價(jià)未發(fā)生改變，均為1∶102400;純化后抗體含量為4.1mg/ml。競(jìng)爭(zhēng)ELISA體系包被抗原的最適包被

3、濃度為0.625μg/ml;最佳包被液為0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液;最佳包被條件為37C2h后4℃過(guò)夜;兔抗犬瘟熱IgG最佳稀釋度為1∶1600;封閉液為5％小牛血清，37℃溫育1h為最佳封閉條件;血清與抗原作用的最佳作用時(shí)間為45min;HRP-羊抗兔IgG做1∶1000倍稀釋，37C溫育1h為最佳酶標(biāo)二抗作用條件;底物最佳反應(yīng)條件為370C避光反應(yīng)15min;確定反應(yīng)陰陽(yáng)抑制率限制為30％;檢測(cè)陰陽(yáng)血清ELISA技術(shù)與

4、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)符合率達(dá)到95.7％、97.8％;所建立的ELISA檢測(cè)技術(shù)與其他貂病沒(méi)有交叉反應(yīng)，表明建立的ELISA診斷技術(shù)具有良好的特異性。膠體金與單抗標(biāo)記的最佳pH為8.2;膠體金最適穩(wěn)定量為30μg/ml;金標(biāo)抗體的最佳稀釋倍數(shù)為1∶2;配方C稀釋金標(biāo)抗體后溶液顏色不變，背景淺，金標(biāo)抗體釋放較完全;利用組裝的試紙條檢測(cè)樣品，陽(yáng)性結(jié)果為試紙條上的T線與C線均呈紅色，陰性結(jié)果僅C線呈紅色;試紙條最低檢測(cè)限為9ng/ml;試劑條在4℃保