糖酵解抑制劑3-溴丙酮酸刺激TNF-α自分泌誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞壞死性凋亡的作用.pdf

1、目的：
　　1.研究己糖激酶抑制劑3-溴丙酮酸（3-bromopyruvate，3-BrPA）對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及死亡的影響。
　　2.研究3-BrPA誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞死亡是否為Caspase依賴性的。
　　3.探討3-BrPA與z-VAD-fmk合用誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生的壞死性凋亡是否為RIP1/RIP3依賴性的。
　　4.探討3-BrPA與z-VAD-fmk合用誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生的壞死性凋亡是否為MLKL依賴性的。

2、
　　5.探討腫瘤壞死因子?在乳腺癌細(xì)胞對(duì)3-BrPA與z-VAD-fmk合用誘導(dǎo)壞死性凋亡敏感性中的作用。
　　方法：
　　1. MTT法檢測(cè)藥物處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MDA-MB-435后對(duì)細(xì)胞存活率的影響。
　　2. ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同濃度3-BrPA（80,160,320μmol·L-1)處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MDA-MB-4356 h后細(xì)胞內(nèi)ATP水平。
　　

3、3.集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞集落形成的影響。
　　4.溴化丙啶（propidium iodide，PI）單染法及Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MDA-MB-43524 h后對(duì)細(xì)胞存活率的影響。
　　5.電鏡觀察藥物處理細(xì)胞后細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的變化。
　　6. Western blot法檢測(cè)藥物處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231對(duì)壞死性凋亡相關(guān)蛋白R(shí)IP

4、1、RIP3、MLKL、TNF-?及??FR1表達(dá)的影響。
　　7. Real-time PCR檢測(cè)藥物處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231后壞死性凋亡相關(guān)蛋白R(shí)IP3及TNF-?信使RNA表達(dá)量的變化。
　　8.利用siRNA技術(shù)下調(diào)RIP1，RIP3，MLKL和TNFR1觀察細(xì)胞對(duì)藥物誘導(dǎo)其發(fā)生壞死性凋亡敏感性的變化。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度3-BrPA對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MDA-MB-

5、435增殖及死亡的影響
　　1.1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度3-BrPA(20，40，80，160，320μmol·L-1)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231有增殖抑制作用，且隨著3-BrPA濃度的增加和作用時(shí)間的延長，對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖抑制作用也不斷增強(qiáng)，而MDA-MB-435細(xì)胞對(duì)此濃度下的3-BrPA不是很敏感。
　　1.2為進(jìn)一步觀察3-BrPA對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MDA-MB-

6、435的增殖抑制作用，實(shí)驗(yàn)中根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用明顯低于MDA-MB-231細(xì)胞半數(shù)抑制濃度的30，40，50μmol·L-1的3-BrPA刺激細(xì)胞，使用集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3-BrPA對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MDA-MB-435增殖抑制作用的影響。結(jié)果表明：低劑量濃度的3-BrPA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞具有增殖抑制作用，而MDA-MB-435細(xì)胞對(duì)此不是很敏感。
　　1.3 ATP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3-BrPA(80

7、，160，320μmol·L-1)對(duì)兩株乳腺癌細(xì)胞內(nèi)的ATP生成均起到抑制作用，且呈濃度依賴性。
　　1.43-BrPA(80，160，320μmol·L-1)處理人乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231、MDA-MB-43524 h，PI單染法檢測(cè)結(jié)果顯示：隨著3-BrPA濃度的增加， MDA-MB-231細(xì)胞的死亡率逐漸增多，而 MDA-MB-435細(xì)胞的死亡率無明顯變化。Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果與單染法所得結(jié)果

8、一致。
　　2.z-VAD-fmk與3-BrPA聯(lián)用誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231發(fā)生壞死性凋亡
　　2.1用160?μmol·L-13-BrPA，10μmol·L-1z-VAD-fmk以及二者合用處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h；用500μmol·L-13-BrPA，10μmol·L-1z-VAD-fmk以及二者合用處理MDA-MB-435細(xì)胞24 h，使用結(jié)晶紫染色后，結(jié)果顯示：z-VAD-fmk可加速3-BrP

9、A在MDA-MB-231細(xì)胞中誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，而對(duì)3-BrPA在 MDA-MB-435細(xì)胞中誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡起明顯的保護(hù)作用。MTT實(shí)驗(yàn)也顯示了相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　2.2我們進(jìn)一步使用電鏡觀察藥物處理后兩株乳腺癌細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果顯示：對(duì)照組 MDA-MB-231細(xì)胞胞漿均勻，胞膜完整；而使用160μmol·L-13-BrPA和10μmol·L-1z-VAD-fmk聯(lián)合處理的MDA-MB-231細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞器腫脹，細(xì)胞膜

10、完整性消失，細(xì)胞內(nèi)容物外泄等壞死性凋亡的特征。與此同時(shí)，對(duì)照組MDA-MB-435細(xì)胞胞漿均勻，胞膜完整；使用320μmol·L-13-BrPA處理的MDA-MB-435細(xì)胞內(nèi)有自噬泡的出現(xiàn)。這提示MDA-MB-435細(xì)胞對(duì)相對(duì)低濃度的3-BrPA不敏感可能是由于細(xì)胞發(fā)生了自噬。
　　3. MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡依賴于RIP1和RIP3的表達(dá)
　　3.1用壞死性凋亡抑制劑 Necrostin-1（10μmol

11、·L-1）處理發(fā)生壞死性凋亡的MDA-MB-231細(xì)胞，使用結(jié)晶紫染色后，結(jié)果顯示，Necrostin-1對(duì)發(fā)生壞死性凋亡的MDA-MB-231細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用。MTT實(shí)驗(yàn)也顯示了相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　3.2 Western blot結(jié)果顯示：在MDA-MB-231細(xì)胞中，聯(lián)合使用160μmol·L-13-BrPA和10μmol·L-1z-VAD-fmk處理組RIP1的表達(dá)量較對(duì)照組，3-BrPA組及z-VAD-fmk組明顯

12、升高。
　　3.3 Real-time PCR結(jié)果顯示：在MDA-MB-231細(xì)胞中，聯(lián)合使用160μmol·L-13-BrPA和10μmol·L-1z-VAD-fmk處理組RIP3信使RNA的表達(dá)量較對(duì)照組，3-BrPA組及z-VAD-fmk組明顯升高。
　　3.4用RIP1 siRNA預(yù)處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，24 h后，Western bolt檢測(cè)RIP1表達(dá)量明顯降低。沉默RIP1的表達(dá)后，用160μm

13、ol·L-13-BrPA和10μmol·L-1z-VAD-fmk聯(lián)合處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h，使用MTT法檢測(cè)其存活率，并與對(duì)照組相比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，RIP1 siRNA預(yù)處理后，3-BrPA與z-VAD-fmk合用誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞產(chǎn)生的壞死性凋亡被明顯抑制。
　　3.5用RIP3 siRNA預(yù)處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，24 h后，Western bolt檢測(cè)RIP3表達(dá)量明顯降

14、低。沉默RIP3的表達(dá)后，用160μmol·L-13-BrPA和10μmol·L-1z-VAD-fmk聯(lián)合處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h，使用MTT法檢測(cè)其存活率，并與對(duì)照組相比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，RIP3 siRNA預(yù)處理后，3-BrPA與z-VAD-fmk合用誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞產(chǎn)生的壞死性凋亡一定程度被抑制。
　　4.下調(diào)MLKL表達(dá)可降低MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)3-BrPA與z-VAD-fmk合

15、用誘壞死性凋亡的敏感性
　　4.1 Western blot結(jié)果顯示：在MDA-MB-231細(xì)胞中，聯(lián)合使用160μmol·L-13-BrPA和10μmol·L-1z-VAD-fmk處理組MLKL的表達(dá)量較對(duì)照組，3-BrPA組，z-VAD-fmk組明顯升高。
　　4.2通過MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，使用MLKL抑制劑NSA可保護(hù)3-BrPA和z-VAD-fmk在MDA-MB-231細(xì)胞中誘導(dǎo)的壞死性凋亡。
　　4.3用MLKL

16、 siRNA預(yù)處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，24 h后，Western bolt檢測(cè)MLKL表達(dá)量明顯降低。沉默MLKL的表達(dá)后，用160μmol·L-13-BrPA和10μmol·L-1z-VAD-fmk聯(lián)合處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h，使用MTT法檢測(cè)其存活率，并與對(duì)照組相比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，MLKL siRNA預(yù)處理后，3-BrPA與z-VAD-fmk合用誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生的壞死性凋亡一

17、定程度被抑制。
　　5.3-BrPA和z-VAD-fmk對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中腫瘤壞死因子?表達(dá)的影響
　　5.1 Real-time PCR結(jié)果顯示：在MDA-MB-231細(xì)胞中，聯(lián)合使用160μmol·L-13-BrPA和10μmol·L-1z-VAD-fmk處理組TNF-α信使RNA的表達(dá)量較對(duì)照組，3-BrPA組及z-VAD-fmk組明顯升高。
　　5.2 Western blot結(jié)果顯示：在MDA-MB

18、-231細(xì)胞中，聯(lián)合使用160μmol·L-13-BrPA和10μmol·L-1z-VAD-fmk處理組TNF-α的表達(dá)量較對(duì)照組，3-BrPA組及z-VAD-fmk組明顯升高。
　　5.3 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用TNF-α抑制劑后，3-BrPA與z-VAD-fmk合用誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生的壞死性凋亡一定程度被抑制，且隨著TNF-α抑制劑濃度的增加，壞死性凋亡率降低。細(xì)胞形態(tài)學(xué)圖片也驗(yàn)證了相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　

19、5.4用TNFR1 siRNA預(yù)處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，24 h后，Western bolt檢測(cè) TNFR1表達(dá)量明顯降低。沉默 TNFR1的表達(dá)后，用160μmol·L-13-BrPA和10μmol·L-1z-VAD-fmk聯(lián)合處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h，使用MTT法檢測(cè)其存活率，并與對(duì)照組相比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比， TNFR1 siRNA預(yù)處理后，3-BrPA與z-VAD-fmk合用誘導(dǎo)MDA-MB