鴨源巴氏桿菌與鴨源沙門氏菌融合菌株的制備及鑒定.pdf

1、細菌原生質(zhì)體融合是一個隨機的過程，通過標記雙親本菌株來篩選陽性融合子。本試驗利用了親本菌株在培養(yǎng)特性及耐藥性兩方面存在的差異，標記親本菌株對融合菌株進行篩選。
　　通過藥敏紙片試驗和最低抑菌濃度試驗(MIC)篩選出兩親本菌株鴨源沙門氏菌(S6)和鴨源巴氏桿菌(CBa)，確定親本菌株藥物標記，藥敏試驗結(jié)果表明鴨源沙門氏菌(S6)對壯觀霉素敏感，抑菌圈為26 mm，鴨源巴氏桿菌(CBa)對壯觀霉素耐藥，抑菌圈為0mm。通過測定最低抑菌

2、濃度(MIC)，確定32μg/ml的壯觀霉素作為選擇培養(yǎng)基的抗生素濃度。壯觀霉素應(yīng)用濃度試驗結(jié)果表明，在含32μg/ml壯觀霉素的麥康凱培養(yǎng)基中S6完全不能生長，在含32μg/ml的新霉素的血瓊脂培養(yǎng)基中CBa能良好生長。
　　篩選出的親本菌株通過紫外分光光度計測量OD600值繪制CBa和S6的生長曲線，確定原生質(zhì)體制備時間:CBa為12-14 h，S6為14-16 h。在溶菌酶的作用下制備原生質(zhì)體，確定制備CBa原生質(zhì)體的最佳溶

3、菌酶濃度為3 g/L，可得到95.25％的原生質(zhì)體制備率以及33.52％的再生率;制備S6原生質(zhì)體的最佳溶菌酶濃度為2.5 g/L，可得到95.32％的原生質(zhì)體制備率以及32.19％的再生率。
　　通過聚乙二醇(PEG)法進行原生質(zhì)體融合，利用抗藥性結(jié)合培養(yǎng)條件對融合子進行篩選，再對融合菌株進行培養(yǎng)特性、菌落形態(tài)、菌體形態(tài)、血清學(xué)試驗、穩(wěn)定性檢測等初步鑒定最終得到5株能夠在32μg/ml壯觀霉素的麥康凱平板上穩(wěn)定遺傳的融合菌株。所

4、得融合子進行血清學(xué)試驗均能凝集雙親菌株陽性血清，菌體形態(tài)為中等大小兩端頓圓的革蘭氏陰性桿菌，能夠在麥康凱培養(yǎng)基長出圓形淡黃色菌落，生化試驗結(jié)果表明氧化酶為陽性，吲哚、枸櫞酸鈉、蔗糖、乳糖、側(cè)金盞花、硫化氫、氰化鉀均為陰性。
　　根據(jù)CBa的外膜蛋白H(OmpH)基因和S6的外膜蛋白A(OmpA)基因的保守區(qū)域設(shè)計兩對引物。利用雙重PCR法檢測5株融合菌株，結(jié)果表明3株能夠同時檢測到雙親本的基因，其余2株則只能檢測到單一親本基因，雙