紫杉醇隱形納米粒節(jié)拍性化療在黑素瘤裸鼠模型中抗腫瘤作用及機(jī)制研究.pdf

1、黑素瘤（melanoma）是極易轉(zhuǎn)移、死亡率較高的皮膚惡性腫瘤。目前，除手術(shù)切除早期黑素瘤外，對(duì)已發(fā)生轉(zhuǎn)移的晚期黑素瘤并無(wú)較好的臨床治療方法。腫瘤血管與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后密切相關(guān)。腫瘤抗血管生成為抗腫瘤治療提供了新的研究思路。目前，已有包括貝伐單抗在內(nèi)的六種腫瘤血管生成抑制劑（Avastin，Nexavar，Votrient，Sutent，Caprelsa和Inlyta）被FDA批準(zhǔn)上市，用于中晚期癌癥患者治療，并體現(xiàn)較好的臨

2、床療效。
　　節(jié)拍性化療（Low-dose metronomic chemotherapy，LDM）是一種新的腫瘤抗血管生成治療策略，指化療藥物按低劑量、間歇期短、長(zhǎng)時(shí)間的一種給藥方式。它有別于最大耐受劑量化療（Maximum Tolerated Dose，MTD），LDM一般為MTD的十分之一到三分之一的劑量范圍，在該劑量下，長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)性給藥能夠增強(qiáng)該化療藥物抗血管生成活性達(dá)到提高抗腫瘤療效并降低毒副作用的目的。
　　目前

3、，節(jié)拍性化療主要聚焦在化療藥物原形藥物上，借助藥物遞送系統(tǒng)（Drug Delivery System，DDS）的節(jié)拍性化療報(bào)道較少。DDS在抗腫瘤治療中已得到廣泛認(rèn)可，其代表性藥物白蛋白紫杉醇（Nab-paclitaxel）和阿霉素脂質(zhì)體（Doxil）已被FDA批準(zhǔn)用于治療卵巢癌和晚期乳腺癌，并取得較好的臨床效果。研究表明，大部分化療藥物都具有抗血管生成活性。其中，紫杉烷類和長(zhǎng)春新堿類藥物的抗血管生成活性最強(qiáng)?；诖耍狙芯拷柚鶳EG化

4、的隱形納米粒載藥系統(tǒng)裝載具有優(yōu)良抗血管生成活性的化療藥物紫杉醇（PTX），以荷B16黑素瘤裸鼠為動(dòng)物模型，進(jìn)行該藥物遞送系統(tǒng)節(jié)拍性化療抗腫瘤作用及其機(jī)制研究。
　　本研究采用開環(huán)聚合法合成CH3O-PEG-PLA聚合物。以該聚合物為載體材料，采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備裝載紫杉醇的隱形納米粒（PTX-NP）。PTX-NP粒徑為110.2nm（DLS檢測(cè)），Zeta電位為-20.13mV。透射電鏡（TEM）和原子力顯微鏡（AFM）觀察納

5、米粒大小均勻，外觀圓整，表面光滑，無(wú)粘附聚集。高效液相色譜（HPLC）分析測(cè)定納米粒載藥量為8.73％，包封率為42.35%。隱形納米粒體外釋放表現(xiàn)為初始突釋和繼后緩慢釋放過(guò)程，在含50%（v:v）大鼠空白血漿的PBS中釋放速度速度快于pH7.4的PBS。SD大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究表明，與Taxol的半衰期（0.58h）相比，PTX-NP體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)至13.48h。與Taxol相比，PTX-NP的AUC提高了30倍。藥動(dòng)學(xué)結(jié)果提示，PTX

6、-NP延長(zhǎng)了藥物體內(nèi)滯留時(shí)間。
　　以黑素瘤細(xì)胞B16和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC為細(xì)胞模型，研究了PTX-NP的體外節(jié)拍性化療細(xì)胞毒性及抗血管生成作用。以香豆素-6為熒光探針，共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）下觀察，隱形納米粒顯著增加HUVEC對(duì)隱形納米粒的攝取。對(duì)其攝取機(jī)制進(jìn)行考查發(fā)現(xiàn)，隱形納米粒是通過(guò)細(xì)胞膜小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞入細(xì)胞，該過(guò)程需要消耗能量。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，PTX濃度為0.01-1nM的試驗(yàn)范圍內(nèi)，空白NP均未引起腫瘤

7、細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制，表明PEG-PLA材料安全無(wú)毒；藥物作用24h時(shí)，市售紫杉醇注射液（Taxol）和PTX-NP對(duì)HUVEC的增殖抑制作用無(wú)顯著性差異；然而，藥物連續(xù)作用216h時(shí)，PTX-NP抑制HUVEC增殖的活性顯著高于Taxol，且呈現(xiàn)濃度依賴性。PTX-NP在PTX濃度小于0.01nM時(shí)抑制HUVEC遷移的活性顯著大于Taxol；PTX-NP在PTX濃度大于0.01nM時(shí)抑制HUVEC小管形成的活性顯著大于Taxol。以

8、DiR作為熒光探針標(biāo)記納米粒，以荷B16黑素癌腫瘤裸鼠為動(dòng)物模型，小動(dòng)物活體成像技術(shù)（Xenogene）考察隱形納米粒腫瘤組織靶向性。給藥48h后解剖裸鼠，小動(dòng)物活體成像儀下觀察腫瘤組織內(nèi)熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，隱形納米粒顯著在腫瘤部位的蓄積量增強(qiáng)，這一結(jié)果提示，隱形納米粒可通過(guò)“EPR效應(yīng)”在腫瘤組織中蓄積。
　　本研究以荷B16黑素瘤裸鼠為動(dòng)物模型，進(jìn)行載藥隱形納米?？鼓[瘤作用及其機(jī)制研究。首先，篩選出PTX-NP用于治療荷B16

9、黑素瘤裸鼠的最大耐受劑量（MTD，30mg/kg）和節(jié)拍性化療劑量（LDM，4mg/kg）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control（p<0.01）、Taxol MTD（p<0.01）、Taxol LDM（p<0.05）和PTX-NPMTD（p<0.05）相比，PTX-NP LDM能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。PTX-N PMTD和Taxol MTD引起荷瘤裸鼠體重減輕，PTX-NP LDM未觀察到任何毒副反應(yīng)。腫瘤組織的免疫組化染色結(jié)果表明，與Contr

10、ol相比，PTX-NP LDM腫瘤組織中TSP-1分泌增加了2.3倍;與PTX-NP MTD相比，PTX-NP LDM腫瘤組織中TSP-1分泌增加了0.68倍，CD31陽(yáng)性的微血管密度則減少58.1%。
　　本研究首先制備PEG化隱形納米粒給藥系統(tǒng)，然后將具有優(yōu)良抗血管生成活性的化療藥物PTX裝載于NP系統(tǒng)中，以此為藥物遞送系統(tǒng)模型進(jìn)行節(jié)拍性化療抗腫瘤作用及其機(jī)制研究。―節(jié)拍性‖靜脈注射后，隱形納米粒通過(guò)EPR（Enhanced