靶向室管膜區(qū)膠原的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子治療大鼠腦缺血卒中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 腦血管病(cerebral vascular diseases，CVD)是危害人類健康及生命的三大疾病之一，而缺血性腦血管病(ischemic cerebralvascular disease, ICD)占其中大部分。我國(guó)腦血管病的患病率高，且有緩慢上升的趨勢(shì)，每年新發(fā)病例超過(guò)150萬(wàn)例。臨床死亡率高，后遺癥多，迫切需要切實(shí)有效的治療方法。
　　 目前，治療ICD除了發(fā)病急性期3-6小時(shí)內(nèi)的溶栓治

2、療外，尚沒(méi)有更為有效的治療措施。但由于溶栓治療的嚴(yán)格時(shí)間窗限制，臨床中符合治療條件的病例即使在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家占總病例的比例也非常低，因此，臨床上大部分的腦缺血治療方案為對(duì)癥保守治療，效果難以令人滿意。
　　 近年，隨著營(yíng)養(yǎng)因子治療在相關(guān)領(lǐng)域的進(jìn)展，多種營(yíng)養(yǎng)因子被用于腦缺血疾病臨床前研究，并且取得令人振奮的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果。越來(lái)越多的研究者積極推動(dòng)這一研究成果向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derivedneuro tr

3、ophic factor，BDNF)是在腦內(nèi)合成的一種蛋白質(zhì)，它廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，對(duì)神經(jīng)元的存活、分化、生長(zhǎng)發(fā)育起重要作用，并能防止神經(jīng)元受損傷死亡、改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)、促進(jìn)受損傷神經(jīng)元再生及分化等生物效應(yīng)。BDNF在腦缺血、脊髓損傷、周圍神經(jīng)損傷、帕金森病等的研究中已經(jīng)取得一定進(jìn)展。
　　 因神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子半衰期短，在局部維持和濃聚困難，治療神經(jīng)損傷時(shí)，需要持續(xù)靜脈注射、反復(fù)多次給藥，或者應(yīng)用

4、人工合成的材料緩釋系統(tǒng)，增加感染及損傷等風(fēng)險(xiǎn)。
　　 CBD(collagen-bingding domain)為多肽結(jié)構(gòu)，是研究膠原酶作用位點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)的膠原結(jié)合區(qū)。應(yīng)用PCR技術(shù)，將CBD-BDNF基因擴(kuò)增，插入pET-28a載體，后轉(zhuǎn)染E.coli，使E.coli表達(dá)目標(biāo)蛋白，在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上以一個(gè)CBD多肽結(jié)構(gòu)修飾，行成CBD-BDNF?？墒笲DNF鉚定于膠原表面，從而形成緩釋系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)證明有CBD多肽的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

5、對(duì)神經(jīng)損傷的修復(fù)作用明顯好于普通神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
　　 在大鼠的室管膜區(qū)，分布著大量Ⅰ型膠原，同時(shí)室管膜下區(qū)(subventricularzone，SVZ)為內(nèi)源性神經(jīng)祖細(xì)胞增殖的主要場(chǎng)所。因此，本課題的目的是研究靶向室管膜區(qū)膠原的BDNF腦內(nèi)移植治療缺血性腦卒中的效果，探討CBD-BDNF治療缺血性腦卒中的是否可以結(jié)合與室管膜區(qū)，在時(shí)間上形成緩釋系統(tǒng)，作用時(shí)間更為長(zhǎng)久，在空間上，更加直接的刺激室管膜下區(qū)的內(nèi)源性神經(jīng)祖細(xì)胞增殖，從

6、而促進(jìn)腦缺血損傷的恢復(fù)，為營(yíng)養(yǎng)因子治療缺血性腦卒中的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究?jī)?nèi)容和方法：
　　 擬建立大鼠大腦中動(dòng)脈梗阻(middle cerebral atery occlusion，MCAO)腦缺血模型，以動(dòng)物模型，研究膠原靶向的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)腦缺血再灌注損傷的作用，為臨床上選擇高效的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。課題研究共分為兩部分。第一部分：以永久線栓法制作大鼠急性腦缺血模型，隨機(jī)分為磷酸鹽緩沖液組，

7、BDNF治療組。在側(cè)腦室內(nèi)分別注射NAT-BDNF10ul(0.5nmol)，CBD-BDNF10ul(0.5nmol)，磷酸鹽緩沖液10ul。在注射后3h，12h，通過(guò)westem評(píng)價(jià)營(yíng)養(yǎng)因子是否能在局部形成緩釋系統(tǒng)。治療后2周，三組分別行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分、免疫組化染色、Micro-PET，SPECT掃描，評(píng)價(jià)CBD-BDNF治療大鼠腦缺血損傷的有效性及可能的作用機(jī)制。第二部分：評(píng)價(jià)micro-Single Photon Emissio

8、n Computed Tomography/ComputedTomography(SPECT/CT)對(duì)大鼠活體狀態(tài)下超急性期腦缺血的診斷價(jià)值。應(yīng)用99mTc-雙半胱乙酯(ECD)腦灌注斷層顯像技術(shù)，選取24只健康雄性成年SD大鼠，以線栓法制作大鼠急性腦缺血模型，術(shù)后6h內(nèi)每隔th分別行SPECT/CT檢查、2,3,5三苯基氯化四氮唑(TTC)染色及HE染色。對(duì)組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間梗死體積的比較采用單因素ANOVA，同一時(shí)間點(diǎn)TTC及SPEC

9、T/CT結(jié)果比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。
　　 研究結(jié)果：
　　 1．通過(guò)westem blot及免疫組化證實(shí)，大鼠腦內(nèi)室管膜分布豐富Ⅰ型膠原。
　　 2．以缺血損傷側(cè)的腦室室管膜膠原基質(zhì)為靶點(diǎn)，使CBD-BDNF在腦缺血損傷局部維持和濃聚，從而形成一個(gè)緩釋系統(tǒng)，在注射后12h，腦室內(nèi)已基本無(wú)NAT-BDNF，但仍可發(fā)現(xiàn)CBD-BDNF在局部濃聚。
　　 3．CBD結(jié)合區(qū)明顯增強(qiáng)BDNF對(duì)損傷的修復(fù)效果。CB

10、D-BDNF治療組神經(jīng)功能恢復(fù)好于NAT-BDNF組及磷酸鹽緩沖液組，在室管膜下區(qū)域細(xì)胞增殖活躍。CBD-BDNF治療組梗塞周邊區(qū)的神經(jīng)元存活數(shù)目及血管密度明顯多于磷酸鹽緩沖液組，micro-PET結(jié)果顯示梗塞側(cè)有代謝活性腦組織增多。SPECT/CT灌注顯像顯示灌注缺失區(qū)域明顯減少。
　　 4．腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能改善腦損傷大鼠的功能；上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，可能是其主要機(jī)制之一。
　

11、　 5．SPECT所示缺血體積與TTC染色梗死區(qū)體積比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。SPECT顯示的低血流灌注區(qū)域，表現(xiàn)為放射性稀疏區(qū)域，與TTC染色粉紅色區(qū)域相對(duì)應(yīng)。缺血3h及以后梗塞面積基本趨于恒定,3h、4h、5h、6h各時(shí)間點(diǎn)梗塞面積比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。HE染色表現(xiàn)：缺血th、2h血管間隙增寬，神經(jīng)細(xì)胞水腫；3h、4h、Sh、6h，神經(jīng)核固縮，血管周圍大量空泡狀改變。
　　 結(jié)論：
　　 1．C